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原文传递一种电化学比率型纸芯片的制备及其在核酸检测中的应用

专利名称：	一种电化学比率型纸芯片的制备及其在核酸检测中的应用
摘要：	本发明公开了一种灵敏度高、稳定性好、操作简单的电化学比率型纸芯片的制备方法并成功应用于核酸的检测。利用蜡打印技术制备所设计的纸芯片，在工作区域生长金纳米片，利用核酸外切酶Ш实现目标物循环信号放大，从而实现核酸的高灵敏检测。将制备好的纸芯片沿折叠线折叠，在自清洗区滴加缓冲液，可实现工作区域的自清洗；在辅助区滴加电解质缓冲溶液，通过比率型的方法可实现对目标物的精准检测，大大提高了传感器的稳定性。此操作简单快速，省时省力，为核酸的灵敏检测提供了一种有效的方法。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	山东;37
申请人：	济南大学
发明人：	于京华;郑晓晓;李丽
专利状态：	有效
申请日期：	2019-08-28T00:00:00+0800
发布日期：	2019-11-22T00:00:00+0800
申请号：	CN201910799902.9
公开号：	CN110487871A
代理机构：	济南誉丰专利代理事务所(普通合伙企业)
代理人：	赵凤
分类号：	G01N27/327(2006.01);G;G01;G01N;G01N27
申请人地址：	250022 山东省济南市南辛庄西路336号
主权项：	1.一种电化学比率型纸芯片的制备及其在核酸检测中的应用，其特征包括以下步骤： 1.1使用Adobe illustrator CS4软件对纸芯片进行亲疏水区域的设计；所述对纸芯片进行亲疏水区域的设计，其特征为：所设计的蜡打印图案包括四个颜色区域，分别为：白色区域、黑色区域、绿色区域和黄色区域，白色区域的四分色所占比例皆为0%；黑色区域四分色所占比例依次为：蓝绿色 0%，洋红色 0%，黄色 0%，黑色 100%；绿色区域四分色所占比例依次为：蓝绿色 75%，洋红色 0%，黄色 100%，黑色 0%；黄色区域四分色所占比例依次为：蓝绿色 0%，洋红色 0%，黄色 10%，黑色 0%； 1.2将2号色谱纸裁剪成A4纸大小，然后使用蜡打印机打印步骤1.1中设计的图案，随后，将蜡打印的纸芯片放到烘箱中烘烤使蜡融化，形成疏水墙，没有打印蜡的部分为亲水区； 1.3在亲水工作区域生长金纳米片，得到金纳米片功能化的工作区，定义为AuNSs/PWE；所述在亲水工作区域生长金纳米片，得到AuNSs/PWE，其特征是包括以下步骤：首先合成金种子溶液：量取80 mL去离子水于三口烧瓶中，加热至90 °C后加入0.8 mL氯金酸，将溶液加热至96 °C并保持1 min，随后加入2.5-3.0 mL质量分数为1%的柠檬酸钠溶液，继续搅拌15 min，自然冷却至室温；其次在纸芯片上生长金纳米片：将合成的金种子溶液滴加到纸芯片亲水工作区，自然晾干，该步骤重复3次，随后将新制备的浓度为200 mM的盐酸羟胺溶液和质量分数为1%的氯金酸溶液快速均匀混合后，取50 μL滴加到纸芯片工作区域并在室温下孵育40 min，使用二次水彻底冲洗纸芯片，室温下自然晾干，得到AuNSs/PWE； 1.4采用丝网印刷的方法，依次将工作电极、对电极和参比电极印到步骤1.3所得到的纸芯片上； 1.5对自动清洗区进行刀刻处理，即用小刀在自清洗区最右侧的半亲水通道上刻上长为20 mm的暗渠； 1.6将修饰有亚甲基蓝的DNA捕获探针，定义为链CP，固定在工作区域，用缓冲溶液清洗后，用巯基己醇减少非特异性吸附位点；所述链CP的固定以及巯基己醇封锁活性位点，其特征是包括以下步骤：移取950 μL含有浓度为10 mM的三（2-羧乙基）膦的Tris-HCl溶液，与50 μL浓度为50 μM的CP混合，将混合溶液放置在暗处静置1 h，随后将50 μL新鲜制备的上述溶液滴加到AuNSs/PWE上，放置在25°C下孵育15小时，得到CP功能化的AuNSs/PWE，最后用50 μL浓度为1 mM 巯基己醇封锁活性位点； 1.7循环放大反应：将修饰有二茂铁的信号探针，定义为链SP，和目标DNA混合，加入核酸外切酶Ш，开启循环放大反应，2 h后，将溶液加热到75 °C 10 min使酶失活；所述的循环放大反应，其特征是包括以下步骤：将浓度为3 μM的SP，目标DNA以及核酸外切酶Ш混合，底液为含0.66 mM MgCl2且pH为8.0的66 mM的Tris-HCl缓冲液，将混合液置于37 °C恒温箱中反应2 h，之后将溶液加热到75 °C 10 min使酶失活，得到修饰有Fc的残基DNA溶液，定义为Re； 1.8将步骤1.7所得到的溶液滴加到步骤1.6所得的纸芯片上孵育2 h； 1.9工作区的自清洗：将步骤1.8所得的纸芯片沿折叠线折叠，在自清洗区滴加pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液，实现工作区的分时自清洗； 1.10精确电化学测定：将步骤1.9所得到的纸芯片沿工作区和辅助区之间的折叠线折叠，在辅助区滴加电解质溶液，将电化学工作站与纸芯片相连接，采用方波伏安法对样品进行测定。 2.根据权利要求1所述的一种电化学比率型纸芯片的制备及其在核酸检测中的应用，其特征在于，将蜡打印的纸芯片放到烘箱中烘烤使蜡融化，形成疏水墙，没有打印蜡的部分为亲水区，所得到纸芯片的具体尺寸如下，工作区域为直径10 mm的圆；工作区域下方的纸芯片为辅助区，即参比和对电极所在区域，直径为11 mm；工作区域上方的纸芯片为自清洗区，在该区，下面的圆是中空的，直径为10 mm，其余的区域都是半亲水区，即正面是亲水区，反面为疏水区，三条半亲水通道的宽为3 mm，在右侧半亲水通道中用小刀刻有长为20 mm的暗渠，用于加快电解质溶液的流动，实现多次自清洗功能；工作区右侧的纸芯片为吸附区，用于吸收清洗工作区域的废液，吸附区的长方形的长与宽分别为25和15 mm。
所属类别：	发明专利