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原文传递一种新生儿苯丙酮尿症无创筛查试纸的制备方法

专利名称：	一种新生儿苯丙酮尿症无创筛查试纸的制备方法
摘要：	本发明涉及一种新生儿苯丙酮尿症无创筛查试纸及其制备方法,所述方法包括如下步骤：第一步，单克隆抗体的制备；第二步，试纸的制备：步骤S7：样品垫的制备，将硝酸纤维素膜切成2530cm，用样品垫处理液浸泡30分钟上，取出烘干，切成相应宽度的2.530cm样品垫条备用；步骤S8：胶体金结合垫的制备；步骤S9：吸水材料的制备；步骤S10：金膜组合；步骤S11：分切；步骤S12：装袋和封口；步骤S13：外包。本发明的有益效果是：通过采集新生儿尿液以试纸法来筛查苯丙酮尿症。最大的优点是无创、简便、标本易得。可避免需采集新生儿足跟血的现有检测方法所致的创伤。避免造成新生儿的疼痛与不安，以及新生儿亲人的极度不安和心疼。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	浙江;33
申请人：	浙江大学
发明人：	翁炳焕;李兰娟;沈筱芸;陈丹青;许亚丽;盛国平
专利状态：	有效
申请日期：	2019-07-22T00:00:00+0800
发布日期：	2019-11-15T00:00:00+0800
申请号：	CN201910659778.6
公开号：	CN110456056A
代理机构：	浙江永鼎律师事务所
代理人：	郭小丽
分类号：	G01N33/577(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	310000浙江省杭州市西湖区浙大路38号
主权项：	1.一种新生儿苯丙酮尿症无创筛查试纸的制备方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：第一步，单克隆抗体的制备：步骤S1: 备置纯度≥95%的半抗原D-Phe，并备置纯度≥95%的筛选原L-Tyr及 L-Try；步骤S2：免疫原制备，将半抗原和筛选原分别与KLH和BSA偶联，制成D-Phe-KLH、D-Phe-BSA、L-Tyr -KLH、L-Tyr- BSA、L-Try -BSA和L-Try- KLH；步骤S3：动物免疫，分别设置A组和B组，其中A组5只Balb/c小鼠，用D-Phe-KLH免疫，然后用D-Phe-BSA检测；B组5只Balb/c小鼠，用D-Phe-BSA免疫，然后用D-Phe-KLH检测，免疫7天后，用间接ELISA和竞争ELISA方法检测免疫动物血清，确定免疫应答水平；步骤S4：细胞融合和筛选，将步骤S3符合免疫应答水平要求的动物免疫细胞与鼠骨髓瘤细胞sp2/0进行细胞融合；步骤S41：初筛，用间接ELISA方法筛选融合细胞培养上清液，挑选出能产生抗苯丙氨酸抗体的阳性克隆；步骤S42：复筛，对初筛得到的能产生抗苯丙氨酸抗体的所有阳性克隆，进行复筛确认；步骤S43：竞争ELISA检测，将经复筛确认的能产生抗苯丙氨酸抗体的所有阳性克隆进行竞争ELISA检测；步骤S44:阳性克隆的扩大培养和冻存，将上述阳性克隆细胞转到24孔板扩大培养，每个扩大培养的克隆收集2ml以上的上清液，用于间接ELISA和竞争ELISA检测，冻存能产生抗苯丙氨酸特异性抗体的阳性克隆细胞；步骤S5：亚克隆，采用有限稀释法对上述阳性克隆进行亚克隆，以获得单克隆细胞，用间接ELISA和竞争ELISA方法进行亚克隆筛选，每个阳性克隆选择至少2个稳定的子克隆进行扩增和低温保存；步骤S6：抗体生产，分别对亚克隆筛选的单克隆细胞进行抗体生产，采用ProteinA/G亲和层析方法纯化抗体，用透析方法将纯化抗体保存在磷酸盐缓冲液中；第二步，试纸的制备步骤S7：样品垫的制备，将硝酸纤维素膜切成2530cm，用样品垫处理液浸泡30分钟上，取出烘干，切成相应宽度的2.530cm样品垫条备用；步骤S8：胶体金结合垫的制备：用氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备胶体金液冷却备用，调整pH值至一定值，加入一定量步骤S6制备的抗体，搅拌30分钟，加入一定量的BSA，搅拌10分钟，离心去上清，加入适量的复溶液复溶至适量体积，振荡均匀，喷涂在硝酸纤维素膜上，37℃干燥4小时以上，沿着喷胶体金复溶液的方向，在保证每条胶体金的完整的情况下，裁成130cm胶体金结合垫备用；步骤S9：吸水材料的制备：将吸水板裁成3.330cm条形备用；步骤S10：金膜组合，将吸水材料、胶体金结合垫、样品垫按照顺序层叠粘在PVC板上，形成成型板；步骤S11：分切：将上述成型板根据需要切成2.5-6mm的条；步骤S12：装袋和封口：将上述条装入铝泊袋中封口备用；步骤S13：外包：将袋装产品装入外包装盒。 2.根据权利要求1所述的新生儿苯丙酮尿症无创筛查试纸的制备方法，其特征在于：步骤S2中偶联的具体操作方法如下： 1.5mg半抗原和筛选原分别与2mgKLH和BSA溶于1.8mlpbs缓冲液中，缓慢滴加1%戊二醛20ul，再加0.15mol/LNaCl至蛋白终浓度为0.1mg/ml ，置振荡器中轻微振荡2.5到3小时，然后添加0.05-0.1mg甘氨酸，轻微振荡20-30min即可。 3.根据权利要求1所述的新生儿苯丙酮尿症无创筛查试纸的制备方法，其特征在于：步骤S3中动物免疫的具体操作方法如下：免疫前采血，然后第一次免疫，剂量和途径为50μg/只，皮下免疫，佐剂为弗氏完全佐剂，第二次免疫为首次免疫后第14天，25μg/只，皮下免疫，佐剂为弗氏不完全佐剂，首次免疫后第21天，采血检测一次，第28天第三次免疫，25μg/只，皮下免疫，佐剂为弗氏不完全佐剂，第35天采血检测，第50±7天，最后一次免疫，25μg/只，静脉免疫，佐剂为弗氏不完全佐剂。 4.根据权利要求3所述的新生儿苯丙酮尿症无创筛查试纸的制备方法，其特征在于：步骤S4细胞融合的动物细胞，其免疫应答水平OD值＞1.0，效价达到1:8000。 5.根据权利要求1所述的新生儿苯丙酮尿症无创筛查试纸的制备方法，其特征在于：步骤S6中抗体质量的控制方法具体为：采用SDS-PAGE，间接ELISA和竞争ELISA进行，抗体浓度采用NanoDrop2000测定，抗体亲和力采用SPR Biacore测定。 6.根据权利要求1所述的新生儿苯丙酮尿症无创筛查试纸的制备方法，其特征在于：步骤S8中调节pH值7.5-8.4，抗体的添加量为每1.0ml胶体金溶液添加5-8μL 0.1mg/mL的抗体，BSA溶液的浓度为1%，添加量为0.1-0.3ml。 7.一种权利要求1-6任意一项所述方法制备的新生儿苯丙酮尿症无创筛查试纸。
所属类别：	发明专利