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原文传递一种干血斑中四种免疫抑制剂检测方法及检测试剂盒

专利名称：	一种干血斑中四种免疫抑制剂检测方法及检测试剂盒
摘要：	本发明提供了一种干血斑中四种免疫抑制剂检测方法及检测试剂盒，其中，干血斑中四种免疫抑制剂检测试剂盒，包括校准品、质控品、内标混合液、第一提取液、第二提取液、复溶液、流动相A、流动相B和洗针液。本发明所述的干血斑中四种免疫抑制剂检测试剂盒，能够提供校准品、样品前处理所涉及的试剂和质控品，免除实验室检测自配的繁琐步骤和造成的误差，保证检测结果的准确性。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	天津;12
申请人：	天津国科医工科技发展有限公司
发明人：	李艳;吴中豪;周传贵;胡玮;韩文念;程文播;许舒欣
专利状态：	有效
申请日期：	2019-07-24T00:00:00+0800
发布日期：	2019-11-19T00:00:00+0800
申请号：	CN201910671899.2
公开号：	CN110470753A
代理机构：	天津滨海科纬知识产权代理有限公司
代理人：	戴文仪
分类号：	G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	300300 天津市东丽区开发区五经路16号4号楼
主权项：	1.一种干血斑中四种免疫抑制剂检测试剂盒，其特征在于：包括校准品、质控品、内标混合液、第一提取液、第二提取液、复溶液、流动相A、流动相B和洗针液；所述内标混合液为西罗莫司-d3、他克莫司-d4和子囊霉素的甲醇溶液。 2.根据权利要求1所述的干血斑中四种免疫抑制剂检测试剂盒，其特征在于：所述校准品为含有梯度浓度免疫抑制剂的干血斑；优选的，所述校准品的制备方法为：先用甲醇稀释免疫抑制剂标准品到梯度浓度，浓度范围分别为环孢霉素A 20-1000ng/mL、西罗莫司2-100ng/mL、他克莫司2-100ng/mL、他克莫司2-100ng/mL，然后与健康全血混合均匀，滴加到干血斑上晾干封装。 3.根据权利要求1所述的干血斑中四种免疫抑制剂检测试剂盒，其特征在于：所述质控品为含有一定浓度免疫抑制剂的干血斑；所述质控品包括第一质控品、第二质控品和第三质控品，且三者浓度依次降低；优选的，所述第一质控品中免疫抑制剂的含量范围分别为：环孢霉素A 800-1000ng/mL，西罗莫司80-100ng/mL，他克莫司80-100ng/mL，依维莫司80-100ng/mL；所述第二质控品中免疫抑制剂的含量范围分别为：环孢霉素A 300-500ng/mL，西罗莫司30-50ng/mL，他克莫司30-50ng/mL，依维莫司30-50ng/mL；所述第三质控品中免疫抑制剂的含量范围分别为：环孢霉素A 20-100ng/mL，西罗莫司2-10ng/mL，他克莫司2-10ng/mL，依维莫司2-10ng/mL。 4.根据权利要求3所述的干血斑中四种免疫抑制剂检测试剂盒，其特征在于：所述质控品的制备方法为：用甲醇分别配制具有第一质控品、第二质控品和第三质控品相应浓度的标准品，然后将相应的标准品与健康全血混合均匀，滴加到干血斑上晾干封装，即得第一质控品、第二质控品和第三质控品。 5.根据权利要求1所述的干血斑中四种免疫抑制剂检测试剂盒，其特征在于：西罗莫司-d3、他克莫司-d4和子囊霉素在内标混合液中的浓度范围分别为300-600ng/mL、100-300ng/mL、100-300ng/mL。 6.根据权利要求1所述的干血斑中四种免疫抑制剂检测试剂盒，其特征在于：所述第一提取液为甲醇和乙腈按体积比1:1混合混合溶液；和/或，所述第二提取液为0.05mol/mL的稀盐酸；和/或，所述复溶液为甲醇；和/或，流动相A为含有0.1％甲酸-2mM乙酸铵的水溶液；和/或，流动相B为含有0.1％甲酸-2mM乙酸铵的甲醇溶液；和/或，所述洗针液甲醇和水按体积比1:1混合的混合溶液。 7.一种干血斑中四种免疫抑制剂的检测方法，其特征在于：采用如权利要求1至6任意一项所述的试剂盒与液相色谱-串联四级杆质谱设备联用进行干血斑中四种免疫抑制剂的检测。 8.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于：包括从干血斑上取下整个血班，将该血班与第一提取液、第二提取液、内标混合液涡旋混合密封，并于40-60℃的条件下超声水浴孵化的步骤；将孵化样品于-25℃--15℃冷冻5-30min,并于4-10℃冷冻离心的步骤。 9.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于：包括以下步骤： (1)样品制备：吸取一定量的全血滴到滤纸上，室温晾干置于塑料密封袋中，冷冻储存备用； (2)样本处理：从干血斑上取下整个血班，将该血班与第一提取液、第二提取液、内标混合液涡旋混合密封，并于40-60℃的条件下超声水浴，孵化20-40min；将孵化样品于-25℃--15℃冷冻5-30min,并于4-10℃冷冻离心,取上清液进行氮吹，再用复溶液复溶进样，用液相色谱-串联四级杆质谱检测； (3)检测结果计算：将标准品出峰面积与对应内标出峰面积的比值作为纵坐标，标准品溶液的浓度作为横坐标，拟合线性方程得到环孢霉素A、西罗莫司、他克莫司、依维莫司的标准曲线；再将质控品样本的峰面积带入标准曲线中计算得到实际的浓度。 10.根据权利要求7-9任意一项所述的检测方法，其特征在于：色谱条件为：流动相A为0.1％甲酸-2mM乙酸铵的水溶液，流动相B为0.1％甲酸-2mM乙酸铵的甲醇溶液；色谱柱为Shim-pack GIST-HP C18 100mm×2.1mm，3μm；柱温为60℃；检测时间为4.5min；进样量为10μL；梯度洗脱条件：0～0.4min，40％B，0.4～2.2min，100％B，2.2～3min，100％B，3～3.5min，40％B，3.5～4min，40％B，流速0.5～1mL/min；和/或，质谱条件为：正离子模式，采用ESI源，碰撞气3Psi，气帘气25psi，雾化气70psi，辅助加热气55psi，喷雾电压4500V，雾化温度300℃。
所属类别：	发明专利