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原文传递基于量子点聚苯乙烯微球检测抗AQP4抗体的方法

专利名称：	基于量子点聚苯乙烯微球检测抗AQP4抗体的方法
摘要：	一种基于量子点聚苯乙烯微球检测抗AQP4抗体的方法，将新型的量子点纳米探针与流式细胞分析技术相结合的免疫方法用于检测自身抗AQP4抗体，突破了传统的以有机荧光染料为检测工具的瓶颈。同时利用了流式细胞分析技术具有快速检测易于标准化和自动化等优点，弥补了现有AQP4抗体检测技术的不足。能够简单快速、可重复检测AQP4抗体。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	广东;44
申请人：	南方医科大学
发明人：	刘天才;李鹏;陈振华
专利状态：	有效
申请日期：	2019-09-10T00:00:00+0800
发布日期：	2019-12-27T00:00:00+0800
申请号：	CN201910854812.5
公开号：	CN110618264A
代理机构：	北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	赵蕊红
分类号：	G01N33/543(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	510515 广东省广州市白云区沙太南路1023号-1063号南方医科大学
主权项：	1.一种基于量子点聚苯乙烯微球检测抗AQP4抗体的方法，包括以下步骤： (1)制备量子点聚苯乙烯QPs微球； (2)获取AQP4蛋白的功能性片段目的基因进行表达； (3)利用EDC-NHS活化QPs微球表面的羧基，并将活化后的QPs微球表面的羧基与AQP4蛋白的氨基进行偶联制成功能化的QPs微球； (4)通过荧光发射峰为600nm至650nm的油溶性CdSe量子点与FITC标记的羊抗人IgG的红绿色双重荧光定位系统进行流式检测，并对已功能化后的QPs微球的检测结果进行判读。 2.根据权利要求1所述的基于量子点聚苯乙烯微球检测抗AQP4抗体的方法，所述步骤(1)采用化学渗透法制备QPs微球，具体过程包括： (1.1)取1mg至10mg的PS微球分散悬浮于0.5mL至1mL的浓度为99.99％的饱和正丁醇溶液中，制成PS微球悬液； (1.2)取0.1mg至1mg的量子点QD溶解于50μL至100μL的的浓度为99.99％的饱和二氯甲烷溶剂中并进行震荡混合，制成QD-二氯甲烷溶液； (1.3)将QD-二氯甲烷溶液以2.5μL/秒至3.5μL/秒的滴速滴加至PS微球悬液中，在室温下震荡4至5小时； (1.4)将震荡后的混合物置于45℃至55℃水温中进行水浴加热20至25小时； (1.5)用体积分数为20％至80％的乙醇溶液对水浴后的混合物进行离心洗涤，收集沉淀物得到QPs微球。 3.根据权利要求2所述的基于量子点聚苯乙烯微球检测抗AQP4抗体的方法，所述步骤(2)具体包括： (2.1)人工合成AQP4蛋白功能性片段目的基因，并将合成后的目的基因插入到pET32a质粒载体中，获得AQP4-pET32a的重组质粒； (2.2)将AQP4-pET32a的重组质粒转化至BL21菌株中，并加入IPTG诱导剂进行诱导表达； (2.3)将诱导表达后得到的蛋白产物进行离心操作，分别取离心后的离心上清液和沉淀物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定； (2.4)将诱导表达后得到的蛋白产物通过镍柱进行纯化，并采用蛋白质印迹法western-bloting再次鉴定。 4.根据权利要求3所述的基于量子点聚苯乙烯微球检测抗AQP4抗体的方法，所述步骤(2.2)具体包括以下步骤：将0.1μg至0.5μg AQP4-pET32a的重组质粒与50μL至100μL体积分数为50％的BL21菌株混匀冰浴至少30分钟，随后将混合菌液置于40℃至45℃的水中进行水浴85秒至95秒，接着再置于0℃环境下冰浴2至3分钟,在35℃至40℃下、以220转每分的转速转动培养混合菌液45分钟以上，将菌液接种涂布含氨苄青霉素的琼脂平板，将琼脂平板置于35℃至40℃环境中孵育24小时以上。 5.根据权利要求说明4所述的基于量子点聚苯乙烯微球检测抗AQP4抗体的方法，其特征在于，所述步骤(2.3)具体包括以下步骤：挑阳性克隆，具体是在35℃至40℃环境下、以220转每分的转速转动培养基，孵育至培养基轻微混浊，将单克隆菌液分为六管且每管放置1mL菌液，按照诱导时间和IPTG稀释比例的不同进行分组，其中诱导时间分为4小时和6小时，IPTG稀释比例分为0，1:1000，1:100三种，具体分组情况如下： 1)诱导时间为4小时，IPTG稀释比例为0为一组； 2)诱导时间为4小时，IPTG稀释比例为1：1000为一组； 3)诱导时间为4小时，IPTG稀释比例为1：100为一组； 4)诱导时间为6小时，IPTG稀释比例为0为一组； 5)诱导时间为6小时，IPTG稀释比例为1：1000为一组； 6)诱导时间为6小时，IPTG稀释比例为1：100为一组。 6.根据权利要求说明5所述的基于量子点聚苯乙烯微球检测抗AQP4抗体的方法，其特征在于，所述步骤(3)具体包括以下步骤： (3.1)QPs微球的预处理：取0.1mg至1mg的QPs微球加入到0.5mL至1mL的PH值为6.1，浓度为50mmol/L的MES buffer缓冲液中混合，将得到的混合物置于18000转每分的转速环境中转动5分钟以上，进行离心操作； (3.2)活化QPs微球：将离心后的产物重置于100μL至500μL的PH值为6.1，浓度为50mmol/L的MES buffer缓冲液中，并分别加入5μg/μL至20μg/μL的EDC试剂和5μg/μL至20μg/μL的NHS试剂混合，在室温环境下对混合后的产物震荡30分钟以上； (3.3)终止活化：将震荡后的混合产物置于18000转每分的环境中转动5分钟以上，进行离心操作，并在离心后的产物中加入0.5mL至1mL的PBS试剂进行洗涤操作2次到3次；所述PBS试剂的PH值范围为7.2至7.4，浓度为0.01mol/L； (3.4)QPs微球偶联AQP4蛋白：将AQP4蛋白与QPs微球置于0.5mL至1mL的PBS试剂中混合，并将混合后的产物置于3℃至45℃的温度中过夜或者在室温的条件下震荡2小时至4小时，完成QPs微球偶联AQP4蛋白的操作；所述PBS试剂的PH值范围为7.2至7.4，浓度为0.01mol/L； (3.5)封闭：在震荡后的混合产物中加入质量浓度3％至5％的BSA试剂，在室温的条件下将混合物震荡30分钟以上； (3.6)终止反应：将加入质量浓度3％至5％的BSA试剂震荡后得到的产物置于18000转每分的转速中转动5分钟以上进行离心操作，并在离心后的产物中加入0.5mL至1mL的PBS试剂进行洗涤操作2次到3次，最后加入100μL至500μL的PBST试剂进行对功能化的QPs微球的重悬；所述PBS试剂的PH值范围为7.2至7.4，浓度为0.01mol/L；所述PBST试剂的PH值范围为7.2至7.4，浓度为0.01mol/L。
所属类别：	发明专利