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原文传递 PAMAM在制备用于免疫检测的试剂中的应用

专利名称：	PAMAM在制备用于免疫检测的试剂中的应用
摘要：	本发明公开了PAMAM在制备用于免疫检测的制剂中的应用。本发明是基于本发明发明人发现PAMAM改性后，分别与活化的酶和特异性抗体共价连接，得到的酶标试剂用于免疫检测，具有灵敏度高，且能够保留酶和抗体活性的优点，所作出的发明创造。本发明提供的高灵敏度的酶标试剂是基于前述应用得到的，可实现信号放大的目的，且制备方法简单，稳定，将其应用于免疫检测，生物素‑亲和素系统不受内源性生物素等影响，检测灵敏度更高，但不会降低检测的特异性，且可以最大限度的保留抗体和酶的活性，将其应用于免疫检测试剂盒，可以为临床检测提供可靠手段。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	广东;44
申请人：	暨南大学
发明人：	陈填烽;刘宏星
专利状态：	有效
申请日期：	2018-12-17T00:00:00+0800
发布日期：	2019-04-26T00:00:00+0800
申请号：	CN201811539516.8
公开号：	CN109682967A
代理机构：	广州市华学知识产权代理有限公司
代理人：	苏运贞
分类号：	G01N33/545(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	510632 广东省广州市天河区黄埔大道西601号
主权项：	1.PAMAM在制备用于免疫检测的试剂中的应用，其特征在于包括以下步骤：将PAMAM的部分氨基羧基化改性，将PAMAM的氨基与活化后的酶通过羟基连接，然后将特异性抗体通过氨基与PAMAM上改性得到的羧基缩合连接，得到用于免疫检测的试剂。 2.根据权利要求1所述的PAMAM在制备用于免疫检测的试剂中的应用，其特征在于：所述的酶为过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、β-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶和6-磷酸葡萄糖脱氧酶中的一种或至少两种；所述的特异性抗体为抗人IgG或抗鼠IgG；所述的免疫检测包括酶联免疫吸附、免疫组化和和免疫印迹。 3.根据权利要求1或2所述的PAMAM在制备用于免疫检测的试剂中的应用，其特征在于：所述的将PAMAM的部分氨基羧基化改性的具体步骤如下：将PAMAM分散在有机溶剂中，加入丁二酸酐，反应，得到部分氨基羧基化改性的PAMAM；所述的PAMAM的用量按其与所述的丁二酸酐＝质量比1:0.05～10配比计算；所述的活化通过如下步骤进行：将酶、NaIO4和水混匀，得到反应体系；反应，得到活化后的酶；所述的NaIO4的用量相当于所述的酶摩尔量的8～100倍；所述的NaIO4在所述的反应体系中的浓度为4.8mg/mL。 4.一种高灵敏度的酶标试剂，其特征在于，是通过权利要求1～3任一项所述的PAMAM在制备用于免疫检测的试剂中的应用制备得到。 5.权利要求4所述的高灵敏度的酶标试剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤： (1)将PAMAM分散在有机溶剂中，加入丁二酸酐，加热，反应，冷却，透析，得到部分氨基羧基化改性的PAMAM； (2)将原料酶、水和NaIO4混匀，得到反应体系；反应，脱盐，得到活化的酶； (3)将步骤(2)得到的活化的酶和步骤(1)得到的部分氨基羧基化改性的PAMAM分散在缓冲液中，反应，纯化，得到PAMAM-酶； (4)将步骤(3)得到的PAMAM-酶和催化剂分散在缓冲液中，反应，加入特异性抗体，继续反应，纯化，得到酶标试剂PAMAM-酶-特异性抗体；步骤(1)中所述的PAMAM的用量为按其与所述的丁二酸酐＝质量比1:0.05～10配比计算；步骤(3)中所述的部分氨基羧基化改性的PAMAM的用量按其与所述的原料酶＝质量比3～5:1配比计算；步骤(4)中所述的特异性抗体的用量按特异性抗体：部分氨基羧基化改性的PAMAM＝质量比4～6:1.5配比计算。 6.根据权利要求5所述的高灵敏度的酶标试剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的原料酶为过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、β-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶和6-磷酸葡萄糖脱氧酶中的一种或至少两种；步骤(4)中所述的催化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺；所述的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的用量按1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐：部分氨基羧基化改性的PAMAM＝质量比10～50:1.5配比计算；所述的N-羟基琥珀酰亚胺的用量按N-羟基琥珀酰亚胺：部分氨基羧基化改性的PAMAMM＝质量比10～50:1.5配比计算；步骤(4)中所述的特异性抗体为抗人IgG或抗鼠IgG。 7.根据权利要求5所述的高灵敏度的酶标试剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的加热的温度为50～70℃；步骤(1)中所述的反应的时间为5～7h；步骤(1)中所述的透析使用的透析袋为1000～3000kDa。 8.根据权利要求5所述的高灵敏度的酶标试剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的有机溶剂为乙酸；步骤(1)中所述的有机溶剂的用量按有机溶剂：PAMAM＝50～100mL:1g配比计算；步骤(2)中所述的水为蒸馏水；步骤(2)中所述的NaIO4的用量相当于所述的原料酶摩尔量的8～100倍；步骤(2)中所述的NaIO4在所述的反应体系中的浓度为4.8mg/mL；步骤(2)所述的脱盐是使用G25脱盐纯化柱进行脱盐；步骤(2)中所述的反应的时间为10～20min；步骤(3)中所述的缓冲液为pH值为9～10的缓冲液；步骤(3)中所述的反应的时间为8～16h；步骤(4)中所述的缓冲液为MES缓冲液；步骤(4)中所述的反应的时间为1～3h；步骤(4)中所述的继续反应的时间为20～28h；步骤(3)和(4)中所述的纯化是使用GE 200凝胶过滤柱进行纯化。 9.权利要求4所述的高灵敏度酶标试剂在制备免疫检测试剂盒中的应用。 10.根据权利要求9所述的高灵敏度酶标试剂在制备免疫检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述的免疫检测包括酶联免疫吸附、免疫组化和免疫印迹。
所属类别：	发明专利