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原文传递一种海氏肠球菌间接血凝抗体检测试剂盒及其制备方法

专利名称：	一种海氏肠球菌间接血凝抗体检测试剂盒及其制备方法
摘要：	本发明公开了一种检测海氏肠球菌血清抗体的间接血凝试剂盒，以及制备和使用这种试剂盒的方法。所述试剂盒中包括：(1)海氏肠球菌间接血凝抗原；(2)标准阳性血清；(3)标准阴性血清；(4)稀释液；并提供了试剂盒的制备和应用方法。本发明提供了一种海氏肠球菌间接血凝抗体检测试剂盒及其应用，该试剂盒操作简单方便，适合在各基层兽医有关单位以及养殖场广泛推广使用；本发明中的试剂盒在检测样品时只需简单的仪器耗材，全程在2‑3小时就能完成；结果判定直观，重复性好。能够快速，稳定，准确的检测海氏肠球菌的抗体。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	甘肃;62
申请人：	中国农业科学院兰州兽医研究所
发明人：	陈启伟;郑福英;宫晓炜;刘永生
专利状态：	有效
申请日期：	2018-06-21T00:00:00+0800
发布日期：	2019-04-26T00:00:00+0800
申请号：	CN201810645844.X
公开号：	CN109682977A
代理机构：	北京轻创知识产权代理有限公司
代理人：	谈杰
分类号：	G01N33/68(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	730000 甘肃省兰州市城关区盐场路
主权项：	1.一种检测海氏肠球菌血清抗体的间接血凝试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：海氏肠球菌间接血凝抗原，4℃保存；标准阳性血清，-20℃冻存；标准阴性血清1瓶，-20℃冻存；稀释液3瓶(10ml/瓶)，4℃保存，其中所述海氏肠球菌间接血凝抗原是将海氏肠球菌菌株CCTCC M 2018115株进行增菌培养后，进行超声破碎，再离心取上清后，作为抗原致敏鞣酸处理过的绵羊红细胞得到的。 2.根据权利要求1所述的一种检测海氏肠球菌血清抗体的间接血凝试剂盒，其特征在于，所述海氏肠球菌间接血凝抗原的制备方法，包括以下步骤： (1)配制阿氏液：柠檬酸钠0.8克，柠檬酸0.055克，葡萄糖2.05克，氯化钠0.42克，双蒸水100ml；混匀后113℃高压10min，冷却至室温后4℃保存； (2)配制磷酸盐缓冲液(0.01M，pH7.2)：称取206.21克Na2HPO4·12H2O，30.46克KH2PO4，68克NaCl，加去离子水，定容至8000ml，混匀后121℃高压20min，冷却至室温保存； (3)静脉采集绵羊红细胞100ml，与100ml灭菌阿氏液混匀，在4℃静置5天，使红细胞充分沉淀；将沉淀好的红细胞摇匀，用灭菌纱布过滤，滤出液收集至大离心管中，以4000r/min离心15min，弃去上清；用磷酸盐缓冲液洗涤红细胞4遍； (4)用磷酸盐缓冲液将红细胞悬浮至5％(v/v)的浓度，与2.5％的戊二醛按照5:1(v/v)的比例慢慢混匀，置磁力搅拌器上搅拌4h，然后用磷酸盐缓冲液洗涤5遍； (5)用磷酸盐缓冲液将上述红细胞悬浮至5％(v/v)的浓度，再与等量1/20000(w/v)的鞣酸溶液混匀，即鞣酸溶液的终浓度为1/40000(w/v)，所用的溶液均为磷酸盐缓冲液；将上述红细胞悬液置于37℃水浴中，静置30min；然后用磷酸盐缓冲液洗涤4遍，最后用磷酸盐缓冲液重悬至5％(v/v)的浓度； (6)将海氏肠球菌的菌液于冰浴中超声破碎20min，然后冻融1次，再超声破碎1次，将破碎后的菌液6000r/min离心15min，取上清，即为用于致敏绵羊红细胞的抗原； (7)以步骤(6)得到的三种用于致敏绵羊红细胞的抗原致敏步骤(5)得到的绵羊红细胞悬液，得到海氏肠球菌间接血凝抗原，抗原致敏红细胞的终浓度为150μg/ml～200μg/ml。 3.根据权利要求1所述的一种检测海氏肠球菌血清抗体的间接血凝试剂盒，其特征在于，所述标准阳性血清的制备方法为：取-80℃冻存的海氏肠球菌甘油菌，用接种环蘸取菌液，划线接种于胰蛋白胨大豆肉汤琼脂平板上，置于37℃、5％CO2箱中培养15～20小时，再挑取单克隆菌株接种于10ml胰蛋白胨大豆肉汤中，37℃，200r/min培养15～18小时，然后把10ml菌液转接到200ml胰蛋白胨大豆肉汤中，继续在37℃摇床中200r/min培养12～15小时，培养完毕后，将全部菌液以6000r/min离心15min，用磷酸盐缓冲液将菌体沉淀洗涤3遍，最后用10ml缓冲液悬浮菌体，吹散混匀，得到超声破碎用海氏肠球菌菌液；再将其置于碎冰中，在超声破碎仪中，以超声5s，间隔1s的程序，超声破碎30min，然后冻融1次，再超声破碎1次；将破碎后的菌液6000r/min离心15min，取上清，用紫外分光光度计测定上清中的蛋白浓度；将上述制备的海氏肠球菌抗原与弗氏完全佐剂等体积混匀，颈部皮下免疫5只体重2.5公斤左右的健康兔，接种抗原量200μg/只，2周后用同等剂量的抗原加强免疫1次，间隔2周后再加强免疫1次；第3次免疫后2周，采血分离血清，用琼脂扩散试验检测血清抗体效价，效价达1:32及以上为合格阳性血清；若达不到标准，可继续加强免疫，直至血清效价符合标准。 4.根据权利要求1所述的一种检测海氏肠球菌血清抗体的间接血凝试剂盒，其特征在于，所述标准阴性血清的制备方法为：选取体重2.5公斤左右、未感染海氏肠球菌的健康樱桃谷鸭，颈动脉放血直至死亡，将血液收集至大离心管中，旋紧盖子，室温过夜，然后3000r/min离心15min，收集血清，经琼脂扩散试验检测，结果为阴性，即为标准阴性血清。 5.根据权利要求1所述的一种检测海氏肠球菌血清抗体的间接血凝试剂盒，其特征在于，所述稀释液的制备方法为：磷酸盐缓冲液中加入1％(v/v)的兔血清和0.01％(w/v)的叠氮钠，即为稀释液；具体制备量可根据实际需要调整。 6.根据权利要求1所述的一种检测海氏肠球菌血清抗体的间接血凝试剂盒，其特征在于，所述海氏肠球菌间接血凝抗体检测试剂盒的使用方法为： a)在96孔110°血凝板1～7排的1～12孔，第8排的1～8孔各加稀释液50μl； b)在血凝板1～6排的第1孔各加1份待检血清，每份血清50μl；用排枪从血凝板1～6排的第1孔开始依次往后作2倍倍比稀释，直至第8孔；在第7排的第1孔加50μl标准阳性血清，依次往后作2倍倍比稀释，至第12孔；在第8排的第1孔加50μl标准阴性血清，依次2倍倍比稀释至第4孔，第5～8孔为空白对照； c)每孔加入充分摇匀的海氏肠球菌间接血凝抗原25μl； d)血凝板置于微量振荡器上振荡1～3分钟，充分混匀，盖上玻璃板，室温或37℃静置1～2小时； e)根据细胞凝集程度判定待检血清效价，以出现50％红细胞凝集时的血清稀释倍数作为该份血清的抗体效价。
所属类别：	发明专利