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原文传递一种氮硫双掺杂氧化石墨烯标记的夹心型免疫传感器的制备方法及应用

专利名称：	一种氮硫双掺杂氧化石墨烯标记的夹心型免疫传感器的制备方法及应用
摘要：	本发明属于免疫分析和生物传感技术领域，提供了一种氮硫双掺杂氧化石墨烯标记的夹心型免疫传感器的制备方法及应用。本发明利用硫堇与金铂核壳枝晶状纳米粒子功能化的氮硫双掺杂氧化石墨烯作为催化材料，与检测抗体孵化后作为标记物，同时利用金纳米棒功能化的聚多巴胺作为电极修饰材料。所构建的夹心型电化学免疫传感器通过差分脉冲伏安法，实现了对心肌肌钙蛋白cTnI、cTnT的定量检测，具备灵敏度高，特异性强，检测限低，对心肌肌钙蛋白的早期检测具有重要的科学意义和应用价值。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	山东;37
申请人：	山东理工大学
发明人：	李月云;吕慧;李新进;徐振;陈磊
专利状态：	有效
申请日期：	2019-02-27T00:00:00+0800
发布日期：	2019-05-03T00:00:00+0800
申请号：	CN201910144057.1
公开号：	CN109709188A
分类号：	G01N27/327(2006.01);G;G01;G01N;G01N27
申请人地址：	255086 山东省淄博市高新技术开发区高创园A座313室
主权项：	1.一种氮硫双掺杂氧化石墨烯标记的夹心型免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将直径为3.0 ~ 5.0 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；（2）取6.0 µL、1.0 ~ 3.0 mg/mL的金纳米棒功能化的聚多巴胺分散液滴涂到电极表面，室温下晾干，超纯水冲洗电极表面，晾干；（3）将6.0 µL、8.0 ~ 12 µg/mL的标志物捕获抗体Ab1滴加到电极表面，超纯水冲洗，4 °C冰箱中晾干；（4）继续将3.0 µL、0.8 ~ 1.2 mg/mL的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，超纯水冲洗电极表面，4 °C冰箱中晾干；（5）滴加6.0 µL、0.00005 ~ 200 ng/mL的一系列不同浓度的标志物抗原Ag溶液，超纯水冲洗电极表面，4 °C冰箱中晾干；（6）将6.0 µL、2.5 ~ 3.5 mg/mL硫堇与金铂核壳枝晶状纳米粒子功能化的氮硫双掺杂氧化石墨烯标记检测抗体分散液滴至电极表面，置于4 °C冰箱中孵化40min，超纯水冲洗电极表面，4 °C冰箱中晾干，制得一种氮硫双掺杂氧化石墨烯标记的夹心型免疫传感器。 2. 如权利要求1所述的一种氮硫双掺杂氧化石墨烯标记的夹心型免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述金纳米棒功能化的聚多巴胺分散液的制备，包括以下步骤：（1）金纳米棒分散液的制备取0.1 mL、25 mM氯金酸溶液，加入4.9 mL超纯水，与5.0 mL、0.2 M十六烷基三甲基溴化铵的水溶液混合；随后，在磁力搅拌下迅速加入1.0 mL、6.0 mM新配制的冰硼氢化钠溶液，室温下静置30min，制得金晶种分散液；称取7.0 g十六烷基三甲基溴化铵和1.234 g油酸钠溶解在250 mL超纯水中，超声至完全溶解后， 30 °C下反应15min；在磁力搅拌下加入250 mL、 1.0 mM 氯金酸溶液，反应90min，依次加入1.0 ~ 1.5 mL抗坏血酸和0.3 ~ 0.5 mL上述制备的金晶种分散液，反应1min，在30 °C下静置12h，得到金纳米棒混合液，超纯水离心洗涤3次，重新分散于10 mL超纯水中，制得金纳米棒分散液；（2）金纳米棒功能化的聚多巴胺分散液的制备在50 mL离心管中依次加入10 ~ 20 mg多巴胺，10 mL、10 mM、pH为8.5的Tris-HCl缓冲液，5.0 mL上述制备的金纳米棒分散液，室温下振荡8h，超纯水离心洗涤3次，制得金纳米棒功能化的聚多巴胺分散液。 3. 如权利要求1所述的一种氮硫双掺杂氧化石墨烯标记的夹心型免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述硫堇与金铂核壳枝晶状纳米粒子功能化的氮硫双掺杂氧化石墨烯标记检测抗体分散液的制备，包括以下步骤：（1）氮硫双掺杂氧化石墨烯的制备称取15 ~ 25 mg 氧化石墨烯加入20 mL超纯水中，超声分散，加入20 ~ 40 mg硫脲，超声5min，转移到聚四氟乙烯高压反应釜中，于180 °C反应12h；自然冷却至室温，超纯水洗涤至中性，在冷冻干燥机中于-50 °C冻干8h，制得氮硫双掺杂氧化石墨烯；所述氧化石墨烯制备方法如下：称取2.0 g石墨粉，在搅拌条件下加入96 mL浓硫酸，反应20min后加入12 g高锰酸钾，在冰水浴条件下搅拌1.5h，加热至55 °C反应5h，依次缓慢加入100 mL超纯水和10 mL、浓度为30%双氧水，搅拌30min后离心分离，在冷冻干燥机中于-50°C冻干12h，制得氧化石墨烯；（2）金铂核壳枝晶状纳米粒子分散液的制备根据权利要求2（1）的步骤制备25 mL金纳米立方分散液，后依次加入1.0 ~ 3.0 mL、0.1 M新配制的抗坏血酸和1.0 mL、10 mM氯亚铂酸钾，于60 °C的水浴中反应12h，自然冷却至室温，用体积比为3：1的超纯水与丙酮得混合液离心洗涤3次，所得沉淀物重新分散在10mL超纯水中，制得金铂核壳枝晶状纳米粒子分散液；（3）硫堇与金铂核壳枝晶状纳米粒子功能化的氮硫双掺杂氧化石墨烯的制备称取10 ~ 20 mg上述制备的氮硫双掺杂氧化石墨烯超声分散在20 mL超纯水中，加入30 ~ 50 µL、0.3 M L-赖氨酸持续超声2h，后加入200 µL上述制备的金铂核壳枝晶状纳米粒子分散液，在室温下搅拌2h；加入10 mg硫堇，在室温下振荡8h，离心洗涤3次，在鼓风干燥箱中于40 °C烘干12h，制得硫堇与金铂核壳枝晶状纳米粒子功能化的氮硫双掺杂氧化石墨烯；（4）硫堇与金铂核壳枝晶状纳米粒子功能化的氮硫双掺杂氧化石墨烯标记检测抗体分散液的制备取5.0 ~ 7.0 mg上述制备的硫堇与金铂核壳枝晶状纳米粒子功能化的氮硫双掺杂氧化石墨烯分散到1.0 mL超纯水中，加入100 µL、80 ~ 120 µg/mL标志物检测抗体溶液和900µL、50 mM、pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液，于恒温振荡培养箱中4 °C条件下振荡孵化8h，离心分离，沉淀再分散到2.0 mL、50 mM、pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液中，制得硫堇与金铂核壳枝晶状纳米粒子功能化的氮硫双掺杂氧化石墨烯标记检测抗体分散液，4 °C下保存备用。 4.如权利要求1所述的一种氮硫双掺杂氧化石墨烯标记的夹心型免疫传感器的制备方法，制备的传感器用于标志物的检测，其特征在于，检测步骤如下：（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，上述制备的传感器为工作电极，在pH为5.5 ~ 8.5的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；（2）采用差分脉冲伏安法对分析物进行检测，初始电位为-0.40 V，终止电位为0 V，脉冲振幅为50 mV，脉冲宽度为50 ms，脉冲周期为500 ms，记录不同浓度标志物抗原所对应的电流峰值，绘制工作曲线，记录电流变化；（3）利用工作曲线法，得到待测样品中标志物抗原的浓度。 5.如权利要求1、3、4任一项所述的标志物，其特征在于，所述标志物选自下列之一：cTnI、cTnT。
所属类别：	发明专利