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原文传递一种虾蟹类眼柄切片制备及其年龄鉴定方法

专利名称：	一种虾蟹类眼柄切片制备及其年龄鉴定方法
摘要：	本发明公开了一种虾蟹类眼柄切片制备及其年龄鉴定方法，涉及虾蟹类眼柄年龄鉴定技术领域，先从虾蟹眼区的眼窝中完整剪下眼柄，然后将眼柄依次经过固定、裁剪、脱钙、脱水和透明预处理，浸蜡包埋、切片处理、切片后处理和封片，该方法制片成功率高、切片可清晰的观察到生长纹，且能获得眼柄从基部到末端的连续切片，每个眼柄可以得到不同位置、不同角度的多个切片采用制备的虾蟹类眼柄切片在显微镜下进行生长纹计数进行年龄的鉴定，方法简单，可直接的鉴定虾蟹类年龄。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	上海;31
申请人：	上海海洋大学
发明人：	连一霖;吴旭干;刘必林;车杰;蒋瑞
专利状态：	有效
申请日期：	2019-01-11T00:00:00+0800
发布日期：	2019-05-07T00:00:00+0800
申请号：	CN201910026369.2
公开号：	CN109724979A
代理机构：	北京风雅颂专利代理有限公司
代理人：	杨红梅
分类号：	G01N21/84(2006.01);G;G01;G01N;G01N21
申请人地址：	200000 上海市浦东新区沪城环路999号
主权项：	1.一种虾蟹类眼柄切片制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：预处理、浸蜡包埋、切片处理、切片后处理和封片，其中，所述的切片处理包括切片、贴片和烤片，所述切片后处理包括脱蜡、复水、染色、脱水和透明。 2.根据权利要求1所述的虾蟹类眼柄切片制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤： 1)预处理：取虾蟹类眼柄，将眼柄置于固定液中，固定12-24h，剔净眼柄内部的结缔组织，并将基部剪平；将裁剪完成后的眼柄置于脱钙液中进行脱钙处理6-12h，清洗后依次进行脱水处理和透明处理，得眼柄A； 2)浸蜡包埋：将眼柄A依次置于熔化的石蜡混合物、石蜡内浸渍，将浸蜡的眼柄和液态石蜡一起倒入包埋盒，待表层液态石蜡开始凝固时，调整眼柄位置，使得眼柄基部与包埋盒底部平行，冷却凝固，得眼柄蜡块； 3)切片处理：将眼柄蜡块切片，得切片蜡带，将切片蜡带移至烤片机在烤片台上贴片，得烤片； 4)切片后处理：将烤片进行浸泡脱蜡，将脱蜡后的切片经过浓度梯度乙醇处理后，浸入流动的水中进行复水，然后依次经过苏木精染色，冲洗，乙醇脱水，伊红染色，将染色后的切片在系列浓度梯度中的脱水剂中进行脱水处理，脱水完成后的切片浸入透明剂中进行透明处理； 5)封片：向步骤(4)处理后的切片上加入中性树脂，盖片，待片干即得到眼柄的石蜡切片。 3.根据权利要求2所述的虾蟹类眼柄切片制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，固定液为Bouin氏液；脱钙液的成分为体积分数为10％甲醛80mL和10％硝酸水溶液20mL的混合液；清洗的溶液为体积分数为70％的乙醇；脱水处理：脱水剂为由低浓度至高浓度的乙醇溶液，浓度梯度和处理时间如下：70％乙醇30min→80％乙醇30min→95％乙醇Ⅰ30min→95％乙醇Ⅱ30min→无水乙醇Ⅰ30min→无水乙醇Ⅱ30min；透明处理：依次浸入第一透明剂和第二透明剂中进行透明处理，所述透明剂一为1:1的无水乙醇和二甲苯混合液，处理时间15-30min，所述透明剂二为二甲苯，处理时间15-30min。 4.根据权利要求2所述的虾蟹类眼柄切片制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中浸渍：温度为55-57℃，石蜡混合物为1:1的石蜡和二甲苯的混合物，浸渍时20-30min，石蜡中浸渍2-3小h。 5.根据权利要求2所述的虾蟹类眼柄切片制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中切片厚度为6-8μm，烤片机温度40℃，贴片时长24h。 6.根据权利要求2所述的虾蟹类眼柄切片制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，浸泡脱蜡的溶液为二甲苯，一次浸泡10min，换液，二次浸泡10min；浓度梯度乙醇处理：50％二甲苯+50％无水乙醇5min→无水乙醇Ⅰ5min→无水乙醇Ⅱ5min→95％乙醇5min→90％乙醇5min→85％乙醇5min；苏木精染色：时长20min；乙醇脱水：分别在体积分数为85％、90％的酒精中脱水5min；伊红染色：时长30s；脱水处理：95％乙醇5min→无水乙醇I 5min→无水乙醇II 5min；透明处理：透明剂为二甲苯，处理时间10min，更换，再次处理10min。 7.根据权利要求6所述的虾蟹类眼柄切片制备方法，其特征在于，所述苏木精染色和伊红染色过程中使用返蓝液处理，所述的返蓝液为浓度1％的氨水或清水，处理时间为1-2min。 8.一种虾蟹类眼柄年龄鉴定方法，其特征在于，采用权利要求1-7任一所述的虾蟹类眼柄切片制备方法获得的切片，进行生长纹计数。 9.根据权利要求8所述的虾蟹类眼柄年龄鉴定方法，其特征在于，所述生长纹计数包括如下步骤： 1)显微镜观察，选择合适倍数，拍摄清楚的生长纹可视视野； 2)生长纹计数：对采集的图像由眼柄内侧向外侧计数生长纹数目。
所属类别：	发明专利