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原文传递一种检测盐酸克伦特罗含量的非竞争法酶联免疫分析方法

专利名称：	一种检测盐酸克伦特罗含量的非竞争法酶联免疫分析方法
摘要：	本发明公开了一种检测盐酸克伦特罗含量的非竞争法酶联免疫分析方法，分别调制抗体的轻链可变区或轻链可变区与其他蛋白的融合蛋白质、重链可变区或重链可变区与噬菌体的融合体、或重链可变区与酶的融合蛋白，利用抗体的轻链可变区和重链可变区同时作用盐酸克伦特罗形成稳定复合体的原理，对盐酸克伦特罗进行检测；本发明检测盐酸克伦特罗含量的非竞争法酶联免疫分析方法，不需要在酶标板上包被盐酸克伦特罗与牛血清蛋白的偶联物或制备盐酸克仑特罗与酶的偶联物，大大降低了检测成本，具有检测速度快，灵敏度高，准确度高，易于实施，检测成本低等优点。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	山东;37
申请人：	山东宽和正生物医药有限公司
发明人：	董金华;董航;单喜军
专利状态：	有效
申请日期：	2018-12-26T00:00:00+0800
发布日期：	2019-05-10T00:00:00+0800
申请号：	CN201811597037.1
公开号：	CN109738645A
代理机构：	山东济南齐鲁科技专利事务所有限公司
代理人：	张娟
分类号：	G01N33/68(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	262700 山东省潍坊市寿光市文圣街南兴安路西潍坊科技学院
主权项：	1.一种检测盐酸克伦特罗含量的非竞争法酶联免疫分析方法，其特征在于：分别调制抗体的轻链可变区或轻链可变区与其他蛋白的融合蛋白质、重链可变区或重链可变区与噬菌体的融合体、或重链可变区与酶的融合蛋白，利用抗体的轻链可变区和重链可变区同时作用盐酸克伦特罗形成稳定复合体的原理，对盐酸克伦特罗进行检测；其中抗体重链可变区的氨基酸序列为： EVNLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYTFYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCASDDYKDYFDYWGQGTTLTV；抗体轻链可变区的氨基酸序列为： ENVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSNTSPKLWIYDTSKLASGVPGRFSGSGSGNSYSLTISSMEAEDVATYYCFQGSGYPFTFGSGTKLEIKR。 2.一种检测盐酸克伦特罗含量的非竞争法酶联免疫分析方法，其特征在于：分别调制抗体的轻链可变区与麦芽糖结合蛋白的融合蛋白质、重链可变区与噬菌体的融合体，利用抗体的轻链可变区和重链可变区同时作用盐酸克伦特罗形成稳定复合体的原理，对盐酸克伦特罗进行检测。 3.根据权利要求2所述的一种检测盐酸克伦特罗含量的非竞争法酶联免疫分析方法，其特征在于：包括以下步骤： ①构建抗体轻链可变区与麦芽糖结合蛋白的融合蛋白；抗体轻链可变区与麦芽糖结合蛋白的融合蛋白的基因序列为： ATGAAAATAAAAACAGGTGCACGCATCCTCGCATTATCCGCATTAACGACGATGATGTTTTCCGCCTCGGCTCTCGCCAAAATCGAAGAAGGTAAACTGGTAATCTGGATTAACGGCGATAAAGGCTATAACGGTCTCGCTGAAGTCGGTAAGAAATTCGAGAAAGATACCGGAATTAAAGTCACCGTTGAGCATCCGGATAAACTGGAAGAGAAATTCCCACAGGTTGCGGCAACTGGCGATGGCCCTGACATTATCTTCTGGGCACACGACCGCTTTGGTGGCTACGCTCAATCTGGCCTGTTGGCTGAAATCACCCCGGACAAAGCGTTCCAGGACAAGCTGTATCCGTTTACCTGGGATGCCGTACGTTACAACGGCAAGCTGATTGCTTACCCGATCGCTGTTGAAGCGTTATCGCTGATTTATAACAAAGATCTGCTGCCGAACCCGCCAAAAACCTGGGAAGAGATCCCGGCGCTGGATAAAGAACTGAAAGCGAAAGGTAAGAGCGCGCTGATGTTCAACCTGCAAGAACCGTACTTCACCTGGCCGCTGATTGCTGCTGACGGGGGTTATGCGTTCAAGTATGAAAACGGCAAGTACGACATTAAAGACGTGGGCGTGGATAACGCTGGCGCGAAAGCGGGTCTGACCTTCCTGGTTGACCTGATTAAAAACAAACACATGAATGCAGACACCGATTACTCCATCGCAGAAGCTGCCTTTAATAAAGGCGAAACAGCGATGACCATCAACGGCCCGTGGGCATGGTCCAACATCGACACCAGCAAAGTGAATTATGGTGTAACGGTACTGCCGACCTTCAAGGGTCAACCATCCAAACCGTTCGTTGGCGTGCTGAGCGCAGGTATTAACGCCGCCAGTCCGAACAAAGAGCTGGCAAAAGAGTTCCTCGAAAACTATCTGCTGACTGATGAAGGTCTGGAAGCGGTTAATAAAGACAAACCGCTGGGTGCCGTAGCGCTGAAGTCTTACGAGGAAGAGTTGGCGAAAGATCCACGTATTGCCGCCACCATGGAAAACGCCCAGAAAGGTGAAATCATGCCGAACATCCCGCAGATGTCCGCTTTCTGGTATGCCGTGCGTACTGCGGTGATCAACGCCGCCAGCGGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCCCTGAAAGACGCGCAGACTAATTCGAGCTCGAACAACAACAACAATAACAATAACAACAACCTCGGGATCGAGGGAAGGATTTCAGAATTCGCGTCGACGGAAAATGTGCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAAAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAAACACCTCCCCCAAACTCTGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCAGGTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAAACTCTTACTCTCTCACGATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGTTGCCACTTATTACTGTTTTCAGGGGAGTGGGTACCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAACGTGCGGCCGCACATCATCATCACCATCACGGGGCCGCAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATGGGGCCGCA； ②构建抗体重链可变区与噬菌体pIII蛋白的融合体；抗体重链可变区与噬菌体pIII蛋白的融合体的基因序列为： ATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGAACCTGGTGGAATCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTAGTGGTGGTAGTTACACCTTCTATCCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGCGATGATTACAAGGACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCGAGCTCACCGGCGTCGGCCGCACATCATCATCACCATCACGGGGCCGCAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATGGGGCCGCATAGACTGTTGAAAGTTGTTTAGCAAAACCTCATACAGAAAATTCATTTACTAACGTCTGGAAAGACGACAAAACTTTAGATCGTTACGCTAACTATGAGGGCTGTCTGTGGAATGCTACAGGCGTTGTGGTTTGTACTGGTGACGAAACTCAGTGTTACGGTACATGGGTTCCTATTGGGCTTGCTATCCCTGAAAATGAGGGTGGTGGCTCTGAGGGTGGCGGTTCTGAGGGTGGCGGTTCTGAGGGTGGCGGTACTAAACCTCCTGAGTACGGTGATACACCTATTCCGGGCTATACTTATATCAACCCTCTCGACGGCACTTATCCGCCTGGTACTGAGCAAAACCCCGCTAATCCTAATCCTTCTCTTGAGGAGTCTCAGCCTCTTAATACTTTCATGTTTCAGAATAATAGGTTCCGAAATAGGCAGGGTGCATTAACTGTTTATACGGGCACTGTTACTCAAGGCACTGACCCCGTTAAAACTTATTACCAGTACACTCCTGTATCATCAAAAGCCATGTATGACGCTTACTGGAACGGTAAATTCAGAGACTGCGCTTTCCATTCTGGCTTTAATGAGGATCCATTCGTTTGTGAATATCAAGGCCAATCGTCTGACCTGCCTCAACCTCCTGTCAATGCTGGCGGCGGCTCTGGTGGTGGTTCTGGTGGCGGCTCTGAGGGTGGCGGCTCTGAGGGTGGCGGTTCTGAGGGTGGCGGCTCTGAGGGTGGCGGTTCCGGTGGCGGCTCCGGTTCCGGTGATTTTGATTATGAAAAAATGGCAAACGCTAATAAGGGGGCTATGACCGAAAATGCCGATGAAAACGCGCTACAGTCTGACGCTAAAGGCAAACTTGATTCTGTCGCTACTGATTACGGTGCTGCTATCGATGGTTTCATTGGTGACGTTTCCGGCCTTGCTAATGGTAATGGTGCTACTGGTGATTTTGCTGGCTCTAATTCCCAAATGGCTCAAGTCGGTGACGGTGATAATTCACCTTTAATGAATAATTTCCGTCAATATTTACCTTCTTTGCCTCAGTCGGTTGAATGTCGCCCTTATGTCTTTGGCGCTGGTAAACCATATGAATTTTCTATTGATTGTGACAAAATAAACTTATTCCGTGGTGTCTTTGCGTTTCTTTTATATGTTGCCACCTTTATGTATGTATTTTCGACGTTTGCTAACATACTGCGTAATAAGGAGTCT； ③在96孔酶标板上包被抗体轻链可变区与麦芽糖结合蛋白的融合蛋白，洗板后加入呈示了抗体重链可变区的噬菌体和不同浓度的盐酸克伦特罗；再次洗板后并向酶标板内加入酶标记的抗噬菌体抗体，反应完成后，洗板，加入酶的底物显色，测定吸光度；绘制盐酸克伦特罗浓度与吸光度的标准曲线，利用标准曲线测定样品中盐酸克伦特罗的含量。 4.根据权利要求3所述的一种检测盐酸克伦特罗含量的非竞争法酶联免疫分析方法，其特征在于：步骤①构建抗体轻链可变区与麦芽糖结合蛋白的融合蛋白的具体操作为：通过执行PCR扩增抗体A2轻链的可变区，PCR反应以A2抗体基因为模板，反应引物为抗体轻链特异引物，引物两端分别附加了SalI和NotI限制酶切点，使用限制酶分别处理扩增的抗体轻链和蛋白表达载体pMAL并纯化，使用T4DNA连接酶将两者连接，转化大肠杆菌XL10-Gold，过夜培养，执行菌簇PCR，筛选阳性克隆，培养后抽取质粒，并对插入载体的基因进行测序确认。 5.根据权利要求3所述的一种检测盐酸克伦特罗含量的非竞争法酶联免疫分析方法，其特征在于：步骤②构建抗体重链可变区与噬菌体的融合体的具体操作步骤为：通过执行PCR扩增抗体A2重链可变区基因，PCR反应以A2抗体基因为模板，反应引物为抗体重链特异引物，引物两端分别附加了NcoI和XhoI限制酶切点，使用限制酶分别处理扩增的抗体重链和噬菌体展示载体pDong1OS并纯化，使用T4DNA连接酶将两者连接，转化大肠杆菌TG-1，培养8～12小时，执行菌簇PCR，筛选阳性克隆，培养后抽取质粒，并对插入载体的基因进行测序确认；挑单克隆阳性菌落至4mL含有100μg/mL氨苄青霉素的2YT培养基，37℃过夜培养，取1mL过夜培养菌液至100mL的含有同样抗生素的2YT培养液，37℃培养大肠杆菌至OD600约为0.4时，加入辅助噬菌体，37℃下孵育30分钟，离心去除上清，加入100mL新鲜的含有氨苄青霉素(100μg/mL)及卡那霉素(50μg/mL)的2YT培养基，悬浮大肠杆菌细胞，30℃过夜培养。次日，离心培养液分离培养上清和大肠杆菌细胞，取80mL的上清至一个新的容器，加入20mL的PEG/NaCl溶液，冰上放置30分钟后，离心，弃上清，用2mL的PBS溶液将沉淀溶解，作为呈示了抗体重链可变区的噬菌体。 6.根据权利要求3所述的一种检测盐酸克伦特罗含量的非竞争法酶联免疫分析方法，其特征在于：标记噬菌体抗体的酶为辣根过氧化酶或碱性磷酸酯酶，其中辣根过氧化酶对应的酶底物分别是3,3,5,5-四甲基联苯胺盐酸盐、碱性磷酸酯酶的酶底物为4-硝基苯磷酸二钠盐。 7.根据权利要求3所述的一种检测盐酸克伦特罗含量的非竞争法酶联免疫分析方法，其特征在于：步骤③中制备标准曲线的具体操作步骤为：在96孔酶标板的孔内加入100μL，5μg/mL抗体轻链可变区与麦芽糖结合蛋白的融合蛋白，在3～5℃下静置，8～12小时后去掉孔内的液体，加入200μL 2％脱脂奶粉溶液，20～30℃下放置两个小时，对酶标板进行封闭；洗板后向微孔内加入100μL含有呈示了抗体重链可变区的噬菌体及各种浓度盐酸克伦特罗的溶液，在25℃孵育1小时，去除孔内溶液，用含有0.1％吐温的PBS溶液洗涤酶标板，加入浓度为1μg/mL，标记了酶的抗噬菌体抗体溶液，在25℃下孵育1小时，去除孔内溶液，用含有0.1％吐温的PBS溶液洗板，最后加入酶底物显色，测定孔内溶液的吸收度，制作标准曲线。 8.根据权利要求7所述的一种检测盐酸克伦特罗含量的非竞争法酶联免疫分析方法，其特征在于：标记噬菌体抗体的酶为辣根过氧化酶或碱性磷酸酯酶，当酶为辣根过氧化酶时，对应的酶底物为3,3,5,5-四甲基联苯胺盐酸盐，测定吸光度时的可见光波长为450nm；当酶为碱性磷酸酯酶时，对应的酶底物为4-硝基苯磷酸二钠盐，测定吸光度时的可见光波长为405nm。
所属类别：	发明专利