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原文传递血液中以氨基酸和酰基肉碱为靶向目标代谢组学分析方法

专利名称：	血液中以氨基酸和酰基肉碱为靶向目标代谢组学分析方法
摘要：	本发明的血液中以氨基酸和酰基肉碱为靶向目标代谢组学分析方法它包括以下步骤：(一)、收集一定数量的新鲜血液样本，得到血清或者血浆样本，按照血液样本贡献者的鉴定结果将上述血清或者血浆样本分成样本群和对照群；(二)、对样本群和对照群中的每个血液样本进行靶向代谢组学前处理；(三)、将样本群和对照群中的每个血液样本送入高效液相色谱串联质谱仪中，对靶向目标物进行精准定量，得到样本群和对照群中的每个血液样本的每种靶向目标物的具体数值；(四)、比较样本群和对照群的每种靶向目标物，选出具有显著差异的靶向目标物；(五)、建立雷达模型，将具有显著差异的靶向目标物画在雷达模型中，找到具有显著差异的靶向目标物之间关系。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	北京;11
申请人：	北京和合医学诊断技术股份有限公司
发明人：	倪君君;许丽
专利状态：	有效
申请日期：	2019-03-04T00:00:00+0800
发布日期：	2019-05-14T00:00:00+0800
申请号：	CN201910159198.0
公开号：	CN109752473A
代理机构：	北京双收知识产权代理有限公司
代理人：	解政文
分类号：	G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	101111 北京市大兴区北京经济技术开发区经海六路5号东尚E园14号楼
主权项：	1.一种血液中以氨基酸和酰基肉碱为靶向目标代谢组学分析方法，其特征在于：它包括以下步骤： (一)、收集一定数量的新鲜血液样本，对上述血液样本进行分离，得到血清或者血浆样本，按照血液样本贡献者的鉴定结果将上述血清或者血浆样本分成样本群和对照群； (二)、对样本群和对照群中的每个血液样本进行靶向代谢组学前处理； (三)、将样本群和对照群中的每个血液样本送入高效液相色谱串联质谱仪中，在高效液相色谱串联质谱仪中对靶向目标物进行精准定量，得到样本群和对照群中的每个血液样本的每种靶向目标物的具体数值； (四)、比较样本群和对照群的每种靶向目标物，选出具有显著差异的靶向目标物。 2.根据权利要求1所述的血液中以氨基酸和酰基肉碱为靶向目标代谢组学分析方法，其特征在于：它还包括： (五)、建立雷达模型，将步骤(四)选出的具有显著差异的靶向目标物画在雷达模型中，找到具有显著差异的靶向目标物之间的关系。 3.根据权利要求2所述的血液中以氨基酸和酰基肉碱为靶向目标代谢组学分析方法，其特征在于：在步骤(一)中，新鲜血液样本收集到后，将新鲜血液样本在采血装置内静置0.5h-3h，然后在转速为3000-4500rmp的离心机中离心5-15min，分离得到的上清液即为血清或者血浆样本，同一份样本分装多份保存；在步骤(二)中，对样本群和对照群中的每个血清或者血浆样本进行靶向代谢组学前处理包含以下步骤： (i)蛋白沉淀将样本群和对照群中的每个血清或者血浆样本与蛋白沉淀剂以一定的比例加入同一容器中，在1000-3000rmp的转速下，对上述容器中的液体进行充分混匀3-15min，得到混匀液，将上述混匀液在转速为10000-15000rmp的离心机中离心5-15min，所得到的上清液转移至另一个干净的容器中，将上清液送入高效液相色谱串联质谱仪中进行质谱分析，或进行步骤(ii)或步骤(iii)的操作；或将上清液在氮气下吹干； (ii)固相萃取将步骤(i)中得到的上清液，加载到经活化的固相萃取小柱上，在固相萃取小柱上加载一定体积洗涤液对上述上清液进行洗涤，然后在固相萃取小柱上加载一定体积洗脱液对其进行洗脱，收集洗脱液，或将洗脱液吹干，并用一定体积复溶液复溶，得到复溶混合液，洗脱液或复溶混合液送入高效液相色谱串联质谱仪中进行质谱分析，或进行步骤(iii)的操作； (iii)液液萃取在步骤(i)中得到的上清液、步骤(ii)得到的洗脱液或步骤(ii)得到的复溶混合液中加入一定体积的萃取剂，将其在1000-3000rmp的转速下充分混匀3-15min，然后，将上述混匀液在转速为10000-15000rmp的离心机中离心5-15min，吸取澄清的上层液或者下层液，并将其转移置另外一个干净的容器中，或将澄清液吹干，并用复溶液复溶，得到复溶混合液，澄清液或者复溶混合液送入高效液相色谱串联质谱仪中进行质谱分析。 4.根据权利要求3所述的血液中以氨基酸和酰基肉碱为靶向目标代谢组学分析方法，其特征在于：在步骤(二)中，对样本群和对照群中的每个血清或者血浆样本进行靶向代谢组学前处理还包括： (iv)添加稳定剂在步骤(一)得到的血清或者血浆样本、步骤(i)得到的上清液、步骤(ii)得到的洗脱液、步骤(ii)得到的复溶混合液、步骤(iii)得到的澄清液或步骤(iii)得到的复溶混合液中添加一定体积的稳定剂，稳定剂与上述溶液进行反应；或者将步骤(i)吹干的上清液中加入一定体积的稳定剂盐酸正丁醇，稳定剂与上述溶液在35-70℃下反应15-45分钟后吹干，然后加入一定体积的复溶液，最后送入高效液相色谱串联质谱仪中进行质谱分析。 5.根据权利要求4所述的血液中以氨基酸和酰基肉碱为靶向目标代谢组学分析方法，其特征在于：所述蛋白沉淀剂为甲醇、乙腈、正丁醇、含有3％-15％高氯酸的水溶液、含有3％-15％三氯乙酸的水溶液或含有3％-15％磺基水杨酸或浓盐酸的水溶液，蛋白沉淀剂的体积：血清或者血浆样本体积为1：1至20：1；所述洗涤液包括：纯水、生理盐水、PBS磷酸盐缓冲溶液、含有0.05％-0.5％甲酸的水溶液、含有1mmol/L-100mmol/L甲酸铵的水溶液、含有1mmol/L-100mmol/L乙酸铵的水溶液或者含有5-30％甲醇或乙腈或无水乙醇的水溶液，洗涤液的体积：血清或者血浆样本体积为1：1至10：1；所述洗脱液包括：甲醇、乙腈、正丁醇、含有0.05％-0.5％甲酸的甲醇溶液、含有0.05％-0.5％甲酸的乙腈溶液、含有0.05％-0.5％甲酸的正丁醇溶液、含有1mmol/L-100mmol/L甲酸铵的甲醇溶液、含有1mmol/L-100mmol/L乙酸铵的甲醇溶液或含有1mmol/L-100mmol/L乙腈的正丁醇溶液，洗脱液的体积：血清或者血浆样本体积为1：2至10：1；所述复溶液包括：以甲醇、乙腈、正丁醇、含有0.05％-0.5％甲酸的甲醇溶液、含有0.05％-0.5％甲酸的乙腈溶液、含有0.05％-0.5％甲酸的正丁醇溶液、含有1mmol/L-100mmol/L甲酸铵的甲醇溶液、含有1mmol/L-100mmol/L乙酸铵的甲醇溶液或含有1mmol/L-100mmol/L乙腈的正丁醇溶液与水的混合液，其中水占0％-50％，复溶液的体积：血清或者血浆样本体积为1：2至5：1；所述萃取剂为正己烷、环己烷、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚和乙醚中一种、两种或两种以上，萃取剂的体积：血清或者血浆样本体积为2：1至10：1；所述稳定剂为甲醇、乙醇、正丁醇、高氯酸、三氯乙酸、磺基水杨酸、盐酸、硫酸、硝酸、维生素C、二硫苏糖醇或盐酸正丁醇，稳定剂的体积：血清或者血浆样本体积为1：20至5：1；所述固相萃取小柱为C18固相萃取柱、强阴离子交换SPE柱、强阳离子交换SPE柱或弱阳离子交换SPE柱。 6.根据权利要求5所述的血液中以氨基酸和酰基肉碱为靶向目标代谢组学分析方法，其特征在于：在步骤(三)中，用高效液相色谱串联质谱仪中对靶向目标物进行精准定量方法包括以下步骤： (I)色谱保留时间的分离采用C18(150mm)色谱柱对靶向目标物进行分离，在色谱柱的柱温25-40℃下，流动相采用梯度洗脱，其中有机相为含有1mmol/L-50mmol/L甲酸铵和含有0.1％-0.3％甲酸的甲醇溶液或者含有1mmol/L-50mmol/L乙酸铵和含有0.1％-0.3％甲酸的甲醇溶液，其中水相为含有1mmol/L-50mmol/L甲酸铵和含有0.1％-0.3％甲酸的水溶液或者含有1mmol/L-50mmol/L乙酸铵和含有0.1％-0.3％甲酸的水溶液。洗脱条件为： 0-(2-3min)：含有15-35％的有机相等度洗脱，流速0.2-0.4ml/min； (2.5-3.5min)：在有机相的比例从15-35％升至40-65％下进行洗脱，流速0.2-0.4ml/min； (2.5-3.5min)-(5.5-6.5min)：含有40-65％有机相等度洗脱，流速0.2-0.4ml/min； (6-7min)：在有机相的比例从40-65％升至75-90％下进行洗脱，流速0.2-0.4ml/min； (6-7min)-(9-10min)：含有75-90％有机相等度洗脱，流速0.2-0.4ml/min； (9.5-10.5min)：在有机相的比例从75-90％升至95-100％下进行洗脱，流速0.2-0.4ml/min； (9.5-10.5min)-(12.5-13.5min)：含有95-100％有机相等度洗脱，流速0.2-0.4ml/min； (13-14min)：在有机相的比例从95-100％降至15-35％下进行洗脱，流速0.2-0.4ml/min； (13-14min)-(15-16min)：含有15-35％有机相等度平衡，流速0.2-0.4ml/min； (II)质谱中质荷比的筛选检测采用正离子MRM扫描模式对21个靶向目标物的质荷比进行检测，具体参数如下： 7.根据权利要求6所述的血液中以氨基酸和酰基肉碱为靶向目标代谢组学分析方法，其特征在于：在步骤(四)中，选出具有显著差异的靶向目标物包括以下步骤： (A)、对样本群和对照群中的每种靶向目标物进行正态检验，当样本群和对照群中某种靶向目标物的正态分布P均≤0.05时；对样本群和对照群间的上述靶向目标物进行方差齐性检验，当方差齐性检验的P>0.05时，对上述靶向目标物进行单因素方差分析，并选出P≤0.05的靶向目标物；当方差齐性检验的P≤0.05时，对上述靶向目标物进行方差不齐性的均值检验，并选出P≤0.05的靶向目标物； (B)、当某种靶向目标物的样本群和对照群中一个正态分布P>0.05时；对样本群和对照群间的上述靶向目标物进行非参数检验，并选出P≤0.05的靶向目标物； (C)、对样本群和对照群中每种靶向目标物进行逻辑回归，并选出P≤0.05的靶向目标物； (D)、将步骤(A)的单因素方差分析和方差不齐性的均值检验分别选出的P≤0.05的靶向目标物、步骤(B)和步骤(C)中分别选出的P≤0.05的靶向目标物集合在一起，即为具有显著差异的靶向目标物；上述P为置信水平。 8.根据权利要求7所述的血液中以氨基酸和酰基肉碱为靶向目标代谢组学分析方法，其特征在于：所述正态性检验包括：KS检验(Kolmogorov-Smirno)、Jarque-Bera检验、Shapiro-Wilk检验、Anderson-Darling检验、Cramér-von-Mises检验、Pearson’s chi-square检验、M检验法(Mudholkar)或D检验法；方差齐性检验包括：Levene’s检验、Bartlett检验、最大F比检验法或最大方差检验法；非参数检验包括：Wilcoxon符号秩检验、Mann-Whitney U检验、Kruskal-Wallis检验、Spearman秩相关检验或Kendall秩相关检验；单因素方差分析包括：one-way ANOVA或t检验；方差不齐性的均值检验包括：t’检验、混合效应模型或方差加权最小二乘法。 9.根据权利要求2所述的血液中以氨基酸和酰基肉碱为靶向目标代谢组学分析方法，其特征在于：在步骤(五)中，建立雷达模型包括以下步骤： (1)筛选数据：选择上述一个样本群和一个对照群，该样本群和对照群中均包括40-200个血液样本，每个血液样本包括：2-10个具有显著差异的靶向目标物； (2)确定分析集与验证集：采用随机原则，将上述样本群中的一定比例的血液样本和对照群样本中同样比例的血液样本进行分组，分为分析集和验证集，在分析集中包括：样本组和对照组，在验证集中包括：样本组和对照组； (3)统计计算分析集中对照组中的每个血液样本的一个靶向目标物的浓度，计算均值和中位数，以均值或中位数作为该靶向目标物的对照组参照值； (4)统计计算分析集中样本组中步骤(3)的靶向目标物的浓度，计算均值和中位数，以均值或中位数作为该靶向目标物的样本组参照值； (5)将分析集中样本组和对照组的上述靶向目标物的浓度转化成该分析集中样本组和对照组的靶向目标物的转换比值，其转换方法包括以下步骤之一： (a)比较该靶向目标物的对照组参照值与该靶向目标物的样本组参照值的大小，当对照组参照值≥样本组参照值时，以该分析集中样本组和对照组的该靶向目标物的浓度为分子，以对照组参照值为分母来计算该分析集中样本组和对照组的该靶向目标物的转换比值；当对照组参照值＜样本组参照值时，以该分析集中样本组和对照组的靶向目标物的浓度为分母，以对照组参照值为分子来计算该分析集中样本组和对照组的该靶向目标物的转换比值； (b)比较该靶向目标物的对照组参照值与该靶向目标物的样本组参照值的大小，当对照组参照值≥样本组参照值时，以该分析集中样本组和对照组的该靶向目标物的浓度为分母，以对照组参照值为分子来计算该分析集中样本组和对照组的该靶向目标物的转换比值；当对照组参照值＜样本组参照值时，以该分析集中样本组和对照组的该靶向目标物的浓度为分子，以对照组参照值为分母来计算该分析集中样本组和对照组的该靶向目标物的转换比值； (6)重复上述步骤(3)至步骤(5)，将分析集内样本组和对照组的血液样本所包括的2-10个靶向目标物浓度转化成为该靶向目标物转换比值，在同一模型中，只选择步骤(5)中的转换方法之一； (7)用分析集中的所有血液样本的上述2-10个靶向目标物的转换比值做雷达图，来建立模型图：在坐标图中，选择一点为圆点，以该圆点为圆心，均匀地作2-10条射线，相邻两条射线之间的夹角相同，在每条射线上均标有相同的长度单位，得到雷达图；将分析集的样本组中的一个靶向目标物的转换比值标注在上述雷达图的同一条射线上，同理，将分析集的样本组中的2-10个靶向目标物的转换比值标注在上述雷达图的相应射线上，在样本组2-10个靶向目标物质转换比值的0-30分位数之间的雷达图上做出一条闭合线，在样本组2-10个靶向目标物质转换比值的70-100分位数之间的雷达图上做出一条闭合线，上述两条闭合线之间的区域为样本组模型区间；将分析集的对照组中的一个靶向目标物的转换比值标注在上述雷达图的同一条射线上，同理，将分析集的对照组中的2-10个靶向目标物的转换比值标注在上述雷达图的相应射线上，在样本组2-10个靶向目标物质转换比值的0-30分位数之间的雷达图上做出一条闭合线，在样本组2-10个靶向目标物质转换比值的70-100分位数之间在雷达图上做出一条闭合线，上述两条闭合线之间的区域为对照组模型区间； (8)模型参数的建立：首先计算分析集中，每个血液样本的2-10个靶向目标物浓度转换值的均值，记做R；观察模型中，每个血液样本落在样本组模型区间内的靶向目标物的个数，记做N； (9)模型判断方法：如果按照步骤(5)中(a)计算分析集中每个血液样本的2-10个靶向目标物的转换值，当R<0.85±0.15和/或N≥(0.5±0.4)靶向目标物的个数时，判断该样本为样本组的血液样本，否则，判断该样本为对照组的血液样本；如果按照步骤(5)中(b)计算分析集中每个血液样本的2-10个靶向目标物的转换值，当R＞1.15±0.15和/或N≥(0.5±0.4)靶向目标物的个数时，判断该样本为样本组的血液样本，否则，判断该样本为对照组的血液样本； (10)模型验证：将验证集中的样本组和对照组中的每个血液样本的2-10靶向目标物的浓度依据步骤(3)至(4)得出相应的对照组参照值和样本组参照值为依据，将步骤(5)中的分析集用验证集替代，来计算该靶向目标物的转换值，将验证集中的样本组和对照组中每个血液样本的2-10靶向目标物转换值带入上述模型，用步骤(8)和步骤(9)的判断方法来对验证集血液样本进行判别，计算模型的敏感性和特异性，敏感性为用该模型中验证出来的验证集中的样本组的血液样本个数与验证集中的血液样本个数的比值；特异性为用该模型中验证出来的验证集中的对照组血液样本个数与验证集中的对照组血液样本个数的比值，当敏感性和特异性均大于0.75时，说明该模型建立成功，否则重新调整步骤(7)中的样本组模型区间和对照组模型区间，直到敏感性和特异性均大于0.75为止。 10.根据权利要求9所述的血液中以氨基酸和酰基肉碱为靶向目标代谢组学分析方法，其特征在于：在步骤(2)中的一定比例为4:1至5:1；在步骤(7)中，所述0分位数的点为在一条射线上，从圆点到0分位数点之间没有任何数据，30分位数的点为在一条射线上，从0分位数和30分位数点之间有30％的数据，70分位数的点为在一条射线上，从0分位数和70分位数点之间有70％的数据，100分位数的点为在一条射线上，从0分位数和100分位数点之间有100％的数据。
所属类别：	发明专利