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原文传递一种乳腺癌自身免疫抗体检测试剂盒及其制备方法与应用

专利名称：	一种乳腺癌自身免疫抗体检测试剂盒及其制备方法与应用
摘要：	本发明的试剂盒采用基因重组Renilla‑多抗原融合蛋白来检测血清中的乳腺癌相关自身免疫抗体，具有较高灵敏度与特异性，为乳腺癌的诊断提供依据，为进一步病理学诊断提供筛选条件。检测快速方便，检测结果准确，对患者无伤害且无放射免疫的污染，可以满足临床诊断的需要，尤其是基层医疗机构和社区全科医生的需求，市场前景广阔。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	浙江;33
申请人：	杭州京北生物科技有限公司
发明人：	唐东起;周扬;陈政鑫
专利状态：	有效
申请日期：	2018-12-17T00:00:00+0800
发布日期：	2019-05-14T00:00:00+0800
申请号：	CN201811546055.7
公开号：	CN109752547A
代理机构：	杭州杭诚专利事务所有限公司
代理人：	尉伟敏
分类号：	G01N33/574(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	311305 浙江省杭州市临安区青山湖科技城创业街178号
主权项：	1.一种乳腺癌自身免疫抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有融合蛋白、缓存液1、酶底物、缓存液2、阴性对照品、阳性对照品与96孔板。 2.根据权利要求1所述的一种乳腺癌自身免疫抗体检测试剂盒，其特征在于，所述融合蛋白由以下方法制备：选取荧光素酶基因和多抗原基因的目的序列HER2抗原基因序列、MUC1抗原基因序列，进行PCR扩增，在kpnl位点GGTACC引入限制性内切酶，获得目的片段，做凝胶电泳进行鉴定；根据HER2基因序列Genebank：NC_000017.11设计引物，正向引物5′CGGGGTACCCCGATGCCCCGG3′，反向引物5′TGCTCTAGATCACACTGG3′，以健康人血清为模板，PCR扩增基因；根据MUC1基因序列Genebank：NC_000001.11设计引物，正向引物5′CGGGGTACCCCGATGACACCG3′，反向引物5′TGCTCTAGACTACAAGTT3′，以健康人血清为模板，PCR扩增基因；将获得的目的片段与PA0815载体质粒分别进行kpnl和xbal双酶切，并使用T4连接酶将目的基因与载体基因连接得到重组质粒；质粒转化与扩繁提取：将重组质粒转化到感受态大肠杆菌中，进行大肠杆菌菌种扩繁，提取重组质粒；融合蛋白的获取：将293改良细胞复苏后37℃，5％二氧化碳培养箱，DMEM培养基培养40-60h，进行细胞传代继续培养40-60h后使用重组质粒进行细胞转染实验，继续在相同条件下培养48h后，使用0.01～0.02mol/L，pH7.0～8.0PBS缓冲液收集细胞；重组融合蛋白的纯化：将收集的细胞用硫酸铵沉淀法进行分级沉淀，沉淀物经0.05～0.08mol/L Tris-Hcl缓冲液冲洗2～3次，后冻干备用；所得融合蛋白用0.01～0.02mol/L，pH7.0～8.0PBS磷酸盐缓冲液进行一定倍数的梯度稀释得融合蛋白稀释液，要求融合蛋白稀释液每10微升中有107个荧光单位。 3.根据权利要求2所述的一种乳腺癌自身免疫抗体检测试剂盒，其特征在于，所述荧光素酶基因为Ranilla荧光素酶基因。 4.根据权利要求2所述的一种乳腺癌自身免疫抗体检测试剂盒，其特征在于，细胞转染实验的方法为磷酸钙转染方法。 5.一种如权利要求1所述的乳腺癌自身免疫抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：荧光素酶基因与抗原基因的融合载体的构建：选取荧光素酶基因和多抗原基因的目的序列HER2抗原基因序列、MUC1抗原基因序列，进行PCR扩增，在kpnl位点GGTACC引入限制性内切酶，获得目的片段，做凝胶电泳进行鉴定；根据HER2基因序列Genebank：NC_000017.11设计引物，正向引物5′CGGGGTACCCCGATGCCCCGG3′，反向引物5′TGCTCTAGATCACACTGG3′，以健康人血清为模板，PCR扩增基因；根据MUC1基因序列Genebank：NC_000001.11设计引物，正向引物5′CGGGGTACCCCGATGACACCG3′，反向引物5′TGCTCTAGACTACAAGTT3′，以健康人血清为模板，PCR扩增基因；将获得的目的片段与PA0815载体质粒分别进行kpnl和xbal双酶切，并使用T4连接酶将目的基因与载体基因连接得到重组质粒；质粒转化与扩繁提取：将重组质粒转化到感受态大肠杆菌中，进行大肠杆菌菌种扩繁，提取重组质粒；融合蛋白的获取：将293改良细胞复苏后37℃，5％二氧化碳培养箱，DMEM培养基培养40-60h，进行细胞传代继续培养40-60h后使用重组质粒进行细胞转染实验，继续在相同条件下培养48h后，使用0.01～0.02mol/L，pH7.0～8.0PBS缓冲液收集细胞；重组融合蛋白的纯化：将收集的细胞用硫酸铵沉淀法进行分级沉淀，沉淀物经0.05～0.08mol/L Tris-Hcl缓冲液冲洗2～3次，后冻干备用；所得融合蛋白用0.01～0.02mol/L，pH7.0～8.0PBS磷酸盐缓冲液进行一定倍数的梯度稀释得融合蛋白稀释液，要求融合蛋白稀释液每10微升中有107个荧光单位。 6.一种如权利要求1所述的乳腺癌自身免疫抗体检测试剂盒的应用，其特征在于，反应体系的组成：融合蛋白、PBS缓冲液、荧光素酶底物、标准品、检测样品； 1.融合蛋白准备：用2ml ddH2O复溶融合蛋白冻干粉，吸打混匀并转移至2mlEP管中，12000rpm离心1min，转移上清至另一新的离心管中，4℃保存备用； 2.试剂用量及孵育：在酶标板中，分别加入检测样品与阴阳性对照品，加入孵育缓冲液，采用一步法进行孵育； 3.孵育：在微孔中加入10ul样品，20ul融合蛋白，70ul孵育缓冲液的混合液100ul/孔，置全自动荧光测定仪中30℃，300rpm振荡孵育60min； 4.洗涤：孵育结束后弃上清，每孔加入200ul PBS，弃上清，扣干，再重复四次，共五次； 5.检测：加入70ulPBS，再加入现配的30ul 1×底物，立即检测。
所属类别：	发明专利