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原文传递用于功能分析多特异性分子的基于SPR的双重结合测定法

专利名称：	用于功能分析多特异性分子的基于SPR的双重结合测定法
摘要：	本文报道了测定抗体与第一和第二抗原结合的方法，所述抗体包含特异性结合所述第一抗原的第一结合位点和特异性结合所述第二抗原的第二结合位点，其中所述方法包括以下步骤：使用特异性结合抗体恒定结构域的捕获试剂将抗体捕获在固相上，孵育捕获的抗体与第一或第二抗原，以形成捕获的抗体‑抗原复合物并测定第一结合信号，i)孵育捕获的抗体‑抗原复合物与没用于形成捕获的抗体‑抗原复合物的抗原，以形成捕获的抗体‑抗原‑抗原复合物并测定第二结合信号，或者ii)再生表面，使用特异性结合抗体恒定结构域的捕获试剂将抗体捕获在固相上，孵育捕获的抗体与没用于形成步骤b)中捕获的抗体‑抗原复合物的抗原，以形成捕获的抗体‑抗原‑抗原复合物并测定第三结合信号，和测定来自第一结合信号和第二或第三结合信号的抗体与第一和第二抗原的总体或单独结合。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	瑞士;CH
申请人：	豪夫迈·罗氏有限公司
发明人：	C·加斯纳;W·梅舍德费尔;J·莫莱肯
专利状态：	有效
申请日期：	2017-09-21T00:00:00+0800
发布日期：	2019-05-21T00:00:00+0800
申请号：	CN201780060075.0
公开号：	CN109791149A
代理机构：	北京市中咨律师事务所
代理人：	陈迎春;黄革生
分类号：	G01N33/543(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	瑞士巴塞尔
主权项：	1.一种测定抗体与第一和第二抗原结合的方法，所述抗体包含特异性结合所述第一抗原的第一结合位点和特异性结合所述第二抗原的第二结合位点，其中所述方法包括以下步骤： a)使用特异性结合抗体恒定结构域的捕获试剂将抗体捕获在固相上， b)孵育捕获的抗体与第一或第二抗原，以形成捕获的抗体-抗原复合物并测定第一结合信号， c)孵育捕获的抗体-抗原复合物与没用于形成捕获的抗体-抗原复合物的抗原，以形成捕获的抗体-抗原-抗原复合物并测定第二结合信号，或者再生表面，使用特异性结合抗体恒定结构域的捕获试剂将抗体捕获在固相上，孵育捕获的抗体与没用于形成步骤b)中捕获的抗体-抗原复合物的抗原，以形成捕获的抗体-抗原复合物并测定第三结合信号，和 d)测定来自第一结合信号和第二或第三结合信号的抗体与第一和第二抗原的总体或单独结合。 2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤d)是 d)如果i)捕获的抗体-抗原复合物的形成获得第一结合信号，和ii)捕获的抗体-抗原-抗原复合物的形成、或者再生后捕获的抗体-抗原复合物的形成获得相对于第一结合信号增加的第二或第三结合信号，则测定抗体与第一和第二抗原的总体或单独结合。 3.一种测定抗体与第一和第二抗原总体和单独结合的方法，所述抗体包含特异性结合所述第一抗原的第一结合位点和特异性结合所述第二抗原的第二结合位点，其中所述方法包括以下步骤： -使用特异性结合抗体恒定结构域的捕获试剂将抗体捕获在固相上， -孵育捕获的抗体与第一或第二抗原，以形成固定的抗体-抗原复合物， -孵育捕获的抗体-抗原复合物与没用于形成捕获的抗体-抗原复合物的抗原，以形成捕获的抗体-抗原-抗原复合物，和 -如果捕获的抗体-抗原复合物的形成获得第一结合信号，和捕获的抗体-抗原-抗原复合物的形成获得相对于第一结合信号增加的第二结合信号，则测定抗体与第一和第二抗原的单独结合，并基于此还测定抗体与第一和第二抗原的总体结合。 4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述固相是表面等离子体共振芯片，所述第一结合信号是表面等离子体共振反应，所述第二结合信号是表面等离子体共振反应。 5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述抗体是双特异性抗体。 6.根据权利要求5所述的方法，其中所述双特异性抗体是CrossMab或DutaFab。 7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述捕获试剂是抗Fc区抗体或抗Fab抗体。 8.根据权利要求7所述的方法，其中所述抗Fab抗体是抗κ轻链抗体或抗λ轻链抗体。 9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述抗体是DutaFab，所述固相是表面等离子体共振芯片，所述捕获试剂是抗κ轻链抗体或抗λ轻链抗体，所述第一结合信号是表面等离子体共振反应，所述第二结合信号是表面等离子体共振反应。 10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中通过以2.5至10μL/min的流速和0.6μg/mL至10μg/mL的浓度注射抗体45至720秒进行捕获。 11.根据权利要求10所述的方法，其中通过以约5μL/min的流速和0.6μg/mL至10μg/mL的浓度注射抗体约60秒进行捕获。 12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中通过以0.5至5μg/mL的浓度注射相应的抗原20至90秒进行孵育。 13.根据权利要求12所述的方法，其中通过以约2μg/mL的浓度注射相应的抗原30或60秒进行孵育。 14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中在包含PBS-T和300mM NaCl的缓冲液中进行孵育。
所属类别：	发明专利