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原文传递一种多聚酶法快速免疫组化试剂盒及其免疫组化方法

专利名称：	一种多聚酶法快速免疫组化试剂盒及其免疫组化方法
摘要：	本发明涉及一种多聚酶法免疫组化试剂盒及其免疫组化方法，该试剂盒包括浓度为10‑20μg/mL的多聚酶HRP标记抗体结合物溶液、DAB显色液和苏木素复染液。本发明的免疫组化方法基于多聚酶技术，采用多个HRP分子聚合成HPR多聚体作为此方法的信号放大系统，采用HRP多聚体与多个一抗分子结合，形成抗体‑HRP结合物作为此方法的反应系统，达到信号放大的效果，无需级联放大。该方法减少了使用二抗的步骤，节约大量时间，同时避免了因二抗产生的非特异性染色。该方法同时满足术中快速检测和术后的临床诊断、疾病研究、指导用药及科学研究等。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	湖北;42
申请人：	武汉原谷生物科技有限责任公司
发明人：	熊雨胜;张薇;郭高升;赵婷婷;周欢
专利状态：	有效
申请日期：	2019-03-14T00:00:00+0800
发布日期：	2019-05-21T00:00:00+0800
申请号：	CN201910193338.6
公开号：	CN109781983A
代理机构：	上海精晟知识产权代理有限公司
代理人：	冯子玲
分类号：	G01N33/573(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	430000 湖北省武汉市东湖新技术开发区高新大道666号武汉国家生物产业(九峰创新)基地B6栋2楼B111室
主权项：	1.一种多聚酶法免疫组化试剂盒，其特征在于，包括浓度为10-20μg/mL的多聚酶HRP标记抗体结合物溶液、DAB显色液和苏木素复染液。 2.根据权利要求1所述的一种多聚酶法免疫组化试剂盒，其特征在于，所述多聚酶HRP标记抗体结合物溶液浓度为10-20μg/mL。 3.根据权利要求1或2任一所述的一种多聚酶法免疫组化试剂盒，其特征在于，所述多聚酶HRP标记抗体结合物溶液是采用抗体稀释液稀释多聚酶HRP标记抗体结合物制备而成；所述抗体稀释液包括5g/L的酪蛋白、1g/L的牛血清蛋白、质量浓度为0.1％的吐温20、质量浓度为0.04％的Proclin300。 4.根据权利要求1所述的一种多聚酶法免疫组化试剂盒，其特征在于，所述多聚酶HRP标记抗体结合物的制备方法为： 1)氧化反应：取8mg辣根过氧化物酶，加8mmol NaIO4，反应20分钟，得到含醛基的HRP； 2)聚合形成多聚酶：步骤1)得到的含醛基的HRP中加入2ml质量浓度为3％的非离子表面活性剂，再用1M Na2CO3-NaHCO3溶液调pH至8.8-9.2，然后4℃旋转反应过夜得多聚酶；所述的非离子表面活性剂为TritonX-100； 3)纯化：步骤2)得到的多聚酶用10mM磷酸盐生理缓冲液透析换液3次，得透析物； 4)连接一抗：取出步骤3)得到的透析物，加入适用于临床诊断的抗体；用10μl浓度为1M的Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液调pH至8.3-8.7，旋转反应4小时； 5)还原稳定化：加入120μl浓度为5mg/ml NaHB4，摇匀，室温静置还原90分钟； 6)纯化：10mM磷酸盐生理缓冲液透析，换液3次，取出透析物，得多聚酶HRP标记抗体结合物。 5.一种基于权利要求1-4任一所述多聚酶法免疫组化试剂盒的快速免疫组化方法，其特征在于，包括如下步骤： (1)取新鲜组织冰冻切片； (2)组织切片固定，晾干，PBS冲洗； (3)抗体孵育：滴加多聚酶HRP标记抗体结合物溶液，孵育2-6min后用PBS冲洗；所述多聚酶HRP标记抗体结合物溶液浓度为10-20μg/mL； (4)滴加DAB显色2-5min后，PBS冲洗； (5)苏木精染色2-3min，水洗后封固。 6.根据权利要求5所述的一种快速免疫组化方法，其特征在于，所述步骤(3)中抗体孵育时间为3-4min。 7.一种基于权利要求1-4任一所述多聚酶法免疫组化试剂盒的免疫组化方法，其特征在于，包括如下步骤： 1)石蜡切片脱蜡-水化-修复/冰切固定； 2)3％H2O2阻断13-18min，PBST/TBST冲洗35min； 3)孵育多聚酶标记抗体37℃25-35min，PBST/TBST冲洗35min； 4)滴加DAB显色2-5min后，PBS冲洗30s； 5)苏木精染色2-3min，蓝化液返蓝； 6)脱水-透明-封片。
所属类别：	发明专利