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原文传递一种高通量富集和鉴定内源性N/O-连接糖肽的方法

专利名称：	一种高通量富集和鉴定内源性N/O-连接糖肽的方法
摘要：	本发明涉及一种基于体积排阻色谱和亲水作用色谱的内源性N‑/O‑连接糖肽的富集和检测方法，并用于肿瘤早期诊断。该发明包括以下四个步骤：1)去除高丰度蛋白质，利用高温变性和体积排阻效应，有效降低蛋白质非特异性吸附并去除干扰蛋白质；2)富集N‑/O‑连接糖肽，利用亲水作用色谱特异性富集N‑/O‑连接糖肽；3)质谱检测，优化质谱碎裂能量实现肽段骨架序列、糖链同时碎裂，基于‘去糖基化肽段索引’和‘理论去糖基化’策略实现糖肽结构解析；4)在此基础上，利用糖肽定量技术实现肿瘤患者与正常人血清中内源性肽段糖基化的精细差异分析，筛选潜在的疾病标志物。本方法实现了血清中内源性肽段糖基化的精细解析，对筛选肿瘤标志物具有重要的应用潜力。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	辽宁;21
申请人：	中国科学院大连化学物理研究所
发明人：	叶明亮;王舒越;秦洪强;王璐;陈尧
专利状态：	有效
申请日期：	2017-11-23T00:00:00+0800
发布日期：	2019-05-31T00:00:00+0800
申请号：	CN201711180038.1
公开号：	CN109828037A
代理机构：	沈阳科苑专利商标代理有限公司
代理人：	马驰
分类号：	G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	116023 辽宁省大连市沙河口区中山路457-41号
主权项：	1.一种高通量富集和鉴定内源性N/O-连接糖肽的方法，其特征在于： (1)血清中高丰度蛋白质的去除：利用酸性条件下高温变性，降低蛋白质-肽段的作用力；基于蛋白质、多肽的分子量差异，利用超滤膜的体积排阻色谱收集内源性肽段； (2)N-/O-连接糖基化肽段的富集：利用改进的亲水作用色谱制作成的Zip-Tip小柱，先加入上样液离心去除非特异性吸附糖肽，再加入洗脱液洗脱糖基化修饰肽段，从而得到完整的内源性糖基化肽段，并取部分样品用PNGase F糖苷酶处理得到去N-连接内源性糖肽，实现完整N-/O-连接内源性糖肽和去糖基化N-连接糖肽的特异性富集； (3)N-/O-连接糖肽的质谱碎裂与谱图解析：结合Q-Extractive高精度质谱搭配纳升级液相系统，采用数据依赖及靶向碎裂的质谱碎裂模式，利用糖基化肽段骨架和糖链能量碎裂的差异，选择基于台阶式的能量碎裂方式，实现N-/O-连接内源性糖肽的肽段骨架和糖链的同时碎裂，提高其鉴定效率； (4)N-/O-连接糖肽的谱图解析：结合Mascot蛋白序列搜索引擎，结合Uniprot数据库，实现N-/O-去糖基化肽段的骨架序列检索；利用Armone糖肽分析软件平台，基于去糖基化肽段索引的策略，进行完整糖基化肽段与去糖基化肽段的匹配，实现N-/O-接内源性完整糖基化肽段的解析。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)的具体方法为： 1)取人源血清/血浆样品，用1％TFA稀释5-12倍体积，置于90-100℃水浴中5-10min，降低蛋白质-多肽之间的相互作用； 2)步骤1)结束后得到的样品，转移至5-30kDa超滤管，经14000g离心20-30min，收集滤出液，再用1％TFA洗两次，合并滤出液冻干，待进行后续样品富集。 3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)的具体方法为： 1)将步骤(1)超滤冻干收集的内源性肽段样品复溶在80％ACN/1％TFA中，并加入点击麦芽糖修饰的亲水材料进行富集，其样品和亲水材料质量比为1/50-1/20，混合振荡孵育30min以上； 2)将步骤1)得到的混合样品填入装有C18筛板的Tip中，在离心1-10min，去除上样液，并加入1-2倍上样液体积的80％ACN/1％TFA离心洗去非特异性吸附，后用等体积30％ACN/1％FA离心洗脱糖肽，收集洗脱液并直接冻干样品，获得内源性糖肽富集样品； 3)将步骤2)得到的完整内源性糖肽取出部分样品，加入50-200微升20mMNH4HCO3后，加入与肽段质量比为500Unites/mg-1000Unites/mg PNGase F糖苷酶，置于37℃水浴锅内酶切18-20h，释放N-连接糖链,得到去N-连接糖链的内源性糖肽。 4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，离心条件为：转速800rpm-2500rpm，离心1-10min。 5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)的具体方法为： 1)将步骤(1)收集得到的完整N-/O-连接内源性糖肽采用Thermo公司的Orbitrap质谱进行完整内源性糖肽的质谱检测，二级谱采用数据依赖的质谱碎裂模式，采用高-低能量结合的质谱碎裂，同时实现N-连接糖的糖链碎裂和O-连接糖基化肽段骨架的碎裂；收集得到的N-连接去糖基化肽段采用数据依赖的质谱碎裂模式，使用HCD高能量碎裂，获得N-连接去糖基化肽段骨架的序列谱图； 2)将步骤1)采集的质谱经过收集其中的糖碎片鎓离子204.08Da、366.10Da，确认O-连接糖的碎片信息，并利用理论去糖基化策略，有效降低谱图的复杂程度，提高O-连接糖基化肽段骨架序列信息，实现内源性O-连接糖肽的鉴定；同时，利用N-连接去糖基化肽段和完整糖基化肽段进行匹配，实现内源性N-连接糖肽的鉴定。 6.根据权利要求1所述方法的应用，其特征在于：该方法能实现内源性糖肽的精细定量信息，包括糖基化位点、位点特异性糖链的差异分析，实现了肿瘤患者与健康人之间糖基化的精细差异分析。
所属类别：	发明专利