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原文传递一种用于咖啡因检测的人工抗体的制备方法

专利名称：	一种用于咖啡因检测的人工抗体的制备方法
摘要：	一种用于咖啡因检测的人工抗体的制备方法，制备的人工抗体洗脱位于印迹球层中的印迹分子，内部形成与印迹分子结构、大小和功能基互补的空穴结构，具有对酶标抗原分子的特异性识别位点，实现对酶标抗原分子选择性识别，利用化学免疫发光法，实现对酶标抗原分子痕量检测，检测限为5.2×10‑11mol·L‑1。人工抗体制备过程包括四个步骤：首先，将辣根过氧化物酶氧化，其次，辣根过氧化物酶标抗原的制备，配置一定浓度梯度的咖啡因抗原，分别滴加氧化的辣根过氧化物酶，选择发光值最大的作为酶标抗原，再次，用印迹分子、功能单体、交联剂、引发剂，制备出目标分子印迹聚合物，最后，洗脱目标分子得到能够选择性识别咖啡因的人工抗体。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	安徽;34
申请人：	合肥学院
发明人：	高大明;陈倩云;吴梦瑶
专利状态：	有效
申请日期：	2019-03-16T00:00:00+0800
发布日期：	2019-05-31T00:00:00+0800
申请号：	CN201910200448.0
公开号：	CN109828108A
分类号：	G01N33/535(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	230601 安徽省合肥市经济开发区锦绣大道99号
主权项：	1.一种用于咖啡因检测的人工抗体的制备方法，其特征在于：所述的人工抗体中洗脱位于聚合物印迹壳层中的印迹分子，印迹壳层的内部形成具有与印迹分子结构、大小和功能基互补的空穴结构，洗脱印迹分子的人工抗体具有对酶标抗原分子的特异性识别位点，实现对酶标抗原分子选择性识别，检测液中存在化学发光剂，利用化学免疫发光法，实现对酶标抗原分子进行痕量检测，上述人工抗体的制备过程包括如下四个步骤： 1.1第一步是辣根过氧化物酶的氧化：称取4 ~ 6mg辣根过氧化物酶溶解于1 ~ 3mL新鲜配制的含有高碘酸钠的醋酸缓冲液中，室温下避光反应20 ~ 40min，加入适量的甘油，室温下继续避光反应5 ~ 15min后，对醋酸缓冲液透析2 ~ 4h，再用的碳酸钠将透析后辣根过氧化物酶溶液的pH值调至9.5备用； 1.2第二步是辣根过氧化物酶标抗原的制备：量取81mL的Na2HPO4、和19mL的NaH2PO4配置pH为7.4的PBS缓冲液，然后用上述的PBS缓冲溶液分别配置浓度为300、30、3、0.3、0.03、0.003 mg•L-1的抗原，用量程范围为10 ~ 100μL的微量进样器吸取40 ~ 60μL的上述活化后的辣根过氧化酶，滴加到上述的不同浓度的抗原溶液中，反应2 ~ 3h后，得到了辣根过氧化物酶标抗原，再用微量进样器分别吸取酶标抗原40 ~ 60μL，滴加到96孔板中，每种浓度的酶标抗原滴加12个平行样，随后在加入酶标抗原的孔中加入140 ~ 160μL的发光液，常温避光振荡器振荡反应4 ~ 6min，用化学发光仪检测其发光值，选择最大发光值为分子印迹的酶标抗原； 1.3第三步是分子印迹聚合物的制备：称取30 ~ 40mg印迹分子置于100mL磨口锥形瓶中，分别加入70 ~ 80mL的乙腈，60 ~ 70μL功能单体，室温下，用振荡器振荡1 ~ 2h，再放置11 ~ 13h，然后加入700 ~ 800μL交联剂和90 ~ 110mg引发剂，通氮气超声4 ~ 6min使其充分混匀后，密封后置于温度可调控的恒温箱，以转速为250 ~ 350r/min，60℃聚合反应18 ~20h后，再调节温度至65℃熟化反应1 ~ 3h，取出锥形瓶冷却至室温，分别用乙醇和去离子水离心超声洗涤反应混合物各三次，得到目标分子印迹聚合物； 1.4第四步是人工抗体的制备：将上述得到的目标分子印迹聚合物用滤纸包裹后放置于洗脱装置中，再将100 ~ 160mL体积比为9:1（mL:mL）的甲醇与乙酸混合溶液加入上述装置中，反复洗脱印迹分子聚合物，直至用紫外分光光度计检测不到混合溶液中印迹分子，然后再用甲醇洗去过量乙酸，将洗脱印迹分子聚合物放置在60℃的干燥箱中干燥，得到了具有对辣根过氧化物酶标抗原识别的人工抗体，然后通过包被液的包被，利用化学发光剂，实现对酶标抗原的检测。 2.根据权利要求1所述的一种用于咖啡因检测的人工抗体的制备方法，其特征是：所述的聚合物印迹壳层中的印迹分子、抗原分子和目标分子都是咖啡因。 3.根据权利要求1所述的一种用于咖啡因检测的人工抗体的制备方法，其特征是：所述的酶标抗原分子是为标记了辣根过氧化物酶的咖啡因。 4.根据权利要求1所述的一种用于咖啡因检测的人工抗体的制备方法，其特征是：所述的化学发光剂为所述的分子印迹聚合物中发光液为鲁米诺溶液、10mL 的三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液和5.2μL的30%双氧水混合溶液。 5.根据权利要求1所述的一种用于咖啡因检测的人工/抗体的制备方法，其特征是：所述的分子印迹聚合物制备中的功能单体是甲基丙烯酸。 6.根据权利要求1所述的一种用于咖啡因检测的人工抗体的制备方法，其特征是：所述的分子印迹聚合物制备中的交联剂是乙二醇二甲基丙烯酸酯。 7.根据权利要求1所述的一种用于咖啡因检测的人工抗体的制备方法，其特征是：所述的分子印迹聚合物制备中的引发剂是偶氮二异丁腈。 8.根据权利要求1所述的一种用于咖啡因检测的人工抗体的制备方法，其特征是：所述的酶标抗原人工抗体的制备中的包被液是5%的PVA甲醇溶液。
所属类别：	发明专利