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原文传递非编码RNA的电化学传感器的制备方法及其应用

专利名称：	非编码RNA的电化学传感器的制备方法及其应用
摘要：	一种非编码RNA的电化学传感器的制备方法，该方法通过一步法制备磺酸化杯[8]芳烃负载的还原氧化石墨烯，用湿热法合成了四氧化三铁纳米材料，并加入金纳米粒子分别合成Au@SCX8‑RGO及Au@Fe3O4复合材料；通过材料表征确认材料构建成功后，以甲苯胺蓝等物质为电信号物质用丝网印刷电极对目标物进行电化学检测。通过该方法制得的电化学生物传感器可实现了对由选择性多聚腺苷酸化（APA）现象所产生的不同长度的非编码区3'UTR转录本表达量的检测。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	云南;53
申请人：	云南大学
发明人：	赵卉;李灿鹏;张亚平;刘凤
专利状态：	有效
申请日期：	2018-06-21T00:00:00+0800
发布日期：	2019-06-04T00:00:00+0800
申请号：	CN201880003841.4
公开号：	CN109844514A
代理机构：	昆明大百科专利事务所
代理人：	苏芸芸
分类号：	G01N27/48(2006.01);G;G01;G01N;G01N27
申请人地址：	650091 云南省昆明市翠湖北路2号
主权项：	1.一种非编码RNA的电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：（1）四氧化三铁纳米微球的制备把三氯化铁水合物加入到乙二醇中形成澄清溶液，并加入乙酸钠和聚乙二醇，搅拌30~60分钟后，放入水热反应釜中加热反应，冷却到室温后得黑色沉淀，用无水乙醇洗涤沉淀，干燥后得到Fe3O4纳米微球；（2）金纳米粒子负载四氧化三铁纳米复合物的制备将步骤（1）Fe3O4 纳米微球分散于超纯水中，超声分散均匀后，依次加聚乙二醇400、柠檬酸三钠、氯金酸和抗坏血酸，搅拌，用磁铁分离后得到黑色沉淀，用无水乙醇洗涤后得到Au@Fe3O4复合物；（3）金纳米粒子/磺酸化杯[8]芳烃/还原氧化石墨烯/电信号物质复合物的制备将4-磺酸杯[8]芳烃水合物、氧化石墨烯分散到去离子水中，超声后调节pH值为7.0 ~12.0，回流反应后，离心，弃去上清液，固体用去离子水洗涤3~4次，得到还原的氧化石墨烯-SCX8复合物；将还原的氧化石墨烯-SCX8复合物分散于去离子水中，超声分散均匀后加入HAuCl4，搅拌、离心分离后弃去上清液，固体用去离子水洗涤，得到Au@RGO-SCX8复合物；把Au@RGO-SCX8复合物超声分散于去离子水中，然后加入电信号物质，搅拌，离心分离得到沉淀，用去离子水洗涤沉淀，最后得到Au@RGO-SCX8-电信号物质复合物；（4）电化学传感器的构建将Au@Fe3O4复合物超声分散在缓冲液Ⅰ中，并加入捕获探针，在4℃的条件下放置5~20小时，磁铁分离，然后在固体加入缓冲液Ⅰ和己硫醇，固体在缓冲液Ⅰ中的浓度为0.5~3 mg/mL，己硫醇用来封闭非特异性位点，室温放置10~40 min后，用磁铁分离，在分离后固体中加入缓冲液Ⅱ和浓度范围在10-18 ~10-9 mol/L的目标RNA，分离后固体在缓冲液Ⅱ中的浓度是0.5~5 mg/mL；室温下放置1~2小时后磁铁分离，在分离的固体中依次加入信号探针、辅助探针和Au@RGO-SCX8-电信号物质复合物分散液，室温下放置1~2小时后磁铁分离，将固体分散在磷酸缓冲液中，取分散液滴于丝网印刷电极表面，并在电化学工作站上用示差脉冲伏安法、循环伏安法或交流伏安法确定目标RNA的浓度和峰电流的关系，并获得电流强度与RNA浓度的标准曲线，进而完成电化学传感器的构建。 2.根据权利要求1所述的非编码RNA的电化学传感器的制备方法，其特征在于：步骤（1）中三氯化铁在乙二醇中的质量体积浓度为0.2%~0.5%，水热反应是在120~220℃下反应5~10小时，干燥是在60~100℃下处理6~10小时，乙酸钠与三氯化铁的质量比为3~6:1，聚乙二醇与三氯化铁的质量比为1:2~3:1。 3.根据权利要求1所述的非编码RNA的电化学传感器的制备方法，其特征在于：步骤（2）中聚乙二醇400、柠檬酸三钠、氯金酸、抗坏血酸的在超纯水中的浓度分别为0.10~0.25 mg/mL、1~5 mg/mL、2~6 mg/mL、1~6 mg/mL。 4.根据权利要求1所述的非编码RNA的电化学传感器的制备方法，其特征在于：步骤（3）中4-磺酸杯[8]芳烃水合物和氧化石墨在去离子水中的质量浓度均为0.1%~0.5%；HAuCl4的在还原的氧化石墨烯-SCX8复合物分散液中的质量浓度为1%~5%。 5.根据权利要求1所述的非编码RNA的电化学传感器的制备方法，其特征在于：步骤（3）中电信号物质为能被4-磺酸杯[8]芳烃水合物识别的电活性物质，每1 mL Au@RGO-SCX8复合物分散液中添加0.2 mg~1mg电信号物质。 6.根据权利要求5所述的非编码RNA的电化学传感器的制备方法，其特征在于：电信号物质为甲苯胺蓝、亚甲基蓝或二茂铁。 7.根据权利要求1所述的非编码RNA的电化学传感器的制备方法，其特征在于：步骤（4）中Au@Fe3O4复合物在缓冲液Ⅰ中的浓度为0.5~3 mg/mL，捕获探针在缓冲液Ⅰ中浓度为0.5~10μmol/L，己硫醇在缓冲液Ⅰ中浓度为1~5 mmol/L；信号探针和辅助探针的初始浓度均为10~20 μmol/L，每1 mg分离的固体中各添加100~150 μL的信号探针和辅助探针；Au@RGO-SCX8-电信号物质复合物分散液的浓度为1~5 mg/mL，每1 mg分离的固体中添加1~1.5 mL的Au@RGO-SCX8-电信号物质复合物分散液。 8.根据权利要求7所述的非编码RNA的电化学传感器的制备方法，其特征在于：缓冲液Ⅰ为含有10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA、300 mmol/L NaCl、1 mmol/L MgCl2的溶液；缓冲液Ⅱ为含有10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA、300 mmol/L NaCl、1 mmol/LTCEP的溶液。 9.根据权利要求1所述的非编码RNA的电化学传感器的制备方法，其特征在于：每0.1mg分离后固体添加2~10 μL浓度范围在10-18 ~10-9 mol/L的目标RNA。 10.权利要求1-9任一项所述的非编码RNA的电化学传感器的制备方法制得的电化学传感器在选择性多聚腺苷酸化检测中的应用，其特征在于：用电化学法检测由APA现象所产生的不同长度的3’UTR转录本表达量。
所属类别：	发明专利