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原文传递差分脉冲伏安法检测miRNA-21的方法

专利名称：	差分脉冲伏安法检测miRNA-21的方法
摘要：	本发明公开了一种差分脉冲伏安法检测miRNA‑21的方法，步骤一、活化电极：滴加miRNA‑21适配体溶液到金电极表面，冲洗吹干；滴加巯基乙醇溶液，冲洗吹干；滴加反应液，冲洗吹干；浸泡于活化液中，冲洗吹干；滴加亚甲基蓝，冲洗吹干，得活化电极；将烯丙基三甲基硅烷溶解于四氢呋喃中，加入羧基化氧化石墨烯超声处理，加入氯化钙超声处理，交替冷冻解冻，取滤液干燥得到粉末，粉末水溶液为活化液；步骤二、利用活化电极检测各浓度的miRNA‑21溶液的电流强度值；计算电流强度值差值与浓度的线性关系；步骤三、检测待测样液的电流强度值，代入线性关系，计算得待测浓度。本发明具有扩宽miRNA‑21的检测限的有益效果。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	广西;45
申请人：	广西师范学院
发明人：	肖琦;黄珊;李家文;金晓宇
专利状态：	有效
申请日期：	2019-03-07T00:00:00+0800
发布日期：	2019-06-07T00:00:00+0800
申请号：	CN201910172724.7
公开号：	CN109856216A
代理机构：	北京远大卓悦知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	靳浩
分类号：	G01N27/327(2006.01);G;G01;G01N;G01N27
申请人地址：	530001 广西壮族自治区南宁市西乡塘区明秀东路175号
主权项：	1.差分脉冲伏安法检测miRNA-21的方法，其特征在于，包括：步骤一、活化电极：a、将浓度为2μM的miRNA-21适配体溶液滴加到金电极表面，置于4℃环境中12h后，用PH为6.8的PBS溶液冲洗40s，再用超纯水冲洗30s用氮气吹干； b、将浓度为1mM的巯基乙醇溶液滴加到步骤a中的金电极表面，直至金电极表面布满巯基乙醇溶液，置于4℃环境中1h后，用PH为6.8的PBS溶液冲洗40s，再用超纯水冲洗30s用氮气吹干； c、将反应液滴加到步骤b中的金电极表面，置于55℃环境中125min后，用PH为6.8的PBS溶液冲洗40s，再用超纯水冲洗30s用氮气吹干，其中，反应液为10mM Tris-HCl，反应液中还含有0.1M的NaCl、1.0mM的MgCl2，0.05U的双链特异性核酸酶； d、将步骤c中的金电极表面浸泡于活化液中，于80℃下静置6h，再用PH为6.8的PBS溶液冲洗40s，然后用超纯水冲洗30s，再用氮气吹干；其中，活化液的制备方法为：将烯丙基三甲基硅烷溶解于四氢呋喃中，使烯丙基三甲基硅烷的浓度为25μM，加入羧基化氧化石墨烯，置于超声频率为100KHz下超声处理30min，静置10min，加入氯化钙，使氧化钙的浓度为10μM，置于超声频率为100KHz下超声处理10min，然后依次置于-1℃下冷冻20min，1℃下解冻15min，-5℃下冷冻15min，1℃下解冻15min，-10℃下冷冻10min，4℃下解冻，过滤取滤液，将滤液干燥得到粉末，再将粉末溶解于超纯水，得到粉末的饱和溶液即为活化液； e、将浓度为1mM的亚甲基蓝滴加到步骤d中的金电极表面，置于4℃环境中100min后，用PH为6.8的PBS溶液冲洗40s，再用超纯水冲洗30s，用氮气吹干，得到活化电极；步骤二、重复步骤一制备多个活化电极，其中，制备多个活化电极的反应液中还含有miRNA-21溶液，且miRNA-21溶液的miRNA-21的浓度不同；步骤三、以银氯化银电极和铂电极分别为参比电极和对电极，以步骤二制备的活化电极为工作电极，搭建多个三电极体系，采用差分脉冲伏安法扫描并计算得到不同浓度的miRNA-21溶液对应的电流强度值；步骤四、以浓度不为0的miRNA-21溶液的电流强度值减去浓度为0的miRNA-21溶液的电流强度值的差值为纵坐标，以miRNA-21溶液的浓度为横坐标，计算得到电流强度值的差值与miRNA-21溶液的浓度的线性关系；步骤五、按照步骤一制备一个活化电极，其中，制备该活化电极中的反应液中加入有10μL含有未知浓度的miRNA-21的待测样液；步骤六、以银氯化银电极和铂电极分别为参比电极和对电极，以步骤五中的活化电极为工作电极，搭建三电极体系，采用差分脉冲伏安法扫描并计算得到待测样液对应的电流强度值，将待测样液对应的电流强度值减去浓度为0的miRNA-21溶液的电流强度值的差值，代入步骤四中的线性关系，计算得到待测样液中miRNA-21的浓度。 2.如权利要求1所述的差分脉冲伏安法检测miRNA-21的方法，其特征在于，还包括：在步骤一之前，对金电极进行以下处理：将金电极置于KH2PO4浓度为3μM、KCl浓度为5μM的超纯水溶液中，且温度为65℃下浸泡40min，用超纯水冲洗后，再置于乙酸浓度为5μM、硅酸浓度为2μM的超纯水溶液中，且温度为80℃下浸泡60min，用超纯水冲洗后，在抛光布上用0.05μm的抛光粉打磨，再用超纯水冲洗干净。 3.如权利要求1所述的差分脉冲伏安法检测miRNA-21的方法，其特征在于， miRNA-21的核苷酸序列为：5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3'； miRNA-21适配体的核苷酸序列为： 5'-TCAACATCAGTCTGATAAGCTATTT-(CH2)6-SH-3'。 4.如权利要求1所述的差分脉冲伏安法检测miRNA-21的方法，其特征在于，步骤二中的miRNA-21溶液的浓度分别为0mol/L、1×10-16mol/L、5×10-16mol/L、1×10-15mol/L、2×10-15mol/L、3×10-15mol/L、5×10-15mol/L，其中，向反应液中加入的miRNA-21溶液的体积为10μL，反应液的总体积为20μL。 5.如权利要求1所述的差分脉冲伏安法检测miRNA-21的方法，其特征在于，步骤三和步骤六中的扫描参数设置为：电位扫描范围为-0.6V～0V，脉冲宽度为0.05s，反应介质液为0.1M的PH7.4的PBS缓冲液。 6.如权利要求1所述的差分脉冲伏安法检测miRNA-21的方法，其特征在于，羧基化氧化石墨烯的制备方法为：将氧化石墨分散于超纯水中，超声处理分散形成均匀的黄色透明胶体溶液，即得氧化石墨烯，然后加入NaOH和一氯乙酸超声处理，使氧化石墨烯上的羟基和环氧基转化为羧基，然后热过滤除去杂质离子，蒸发掉多余水分，再在65℃下真空干燥得到羧基化氧化石墨烯，其中，氧化石墨、超纯水、NaOH、一氯乙酸的质量体积比为100mg:100mL:6.0g:5.0g。
所属类别：	发明专利