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原文传递一种快速测定全细胞生物催化合成乙偶姻的方法

专利名称：	一种快速测定全细胞生物催化合成乙偶姻的方法
摘要：	本发明公开了一种快速测定全细胞生物催化合成乙偶姻的方法，属于生物检测技术领域；本发明将全细胞生物催化反应合成的乙偶姻与显色剂混合进行显色反应，测定反应后混合液的OD522，并根据乙偶姻标准品的吸光度标准曲线，计算合成样品中乙偶姻含量；本发明方法具有直观、简便快速、重复性好和检测成本低等特点，适用于工业化应用。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	云南;53
申请人：	昆明理工大学
发明人：	罗义勇;刀娅;杨娟
专利状态：	有效
申请日期：	2018-12-24T00:00:00+0800
发布日期：	2019-06-07T00:00:00+0800
申请号：	CN201811577884.1
公开号：	CN109856127A
代理机构：	昆明人从众知识产权代理有限公司
代理人：	沈艳尼
分类号：	G01N21/78(2006.01);G;G01;G01N;G01N21
申请人地址：	650093 云南省昆明市五华区学府路253号
主权项：	1.一种快速测定全细胞生物催化合成乙偶姻的方法，其特征在于：将全细胞生物催化反应合成的乙偶姻与显色剂混合进行显色反应，测定反应后混合液的OD522，并根据乙偶姻标准品的吸光度标准曲线，计算合成样品中乙偶姻含量。 2.根据权利要求1所述的快速测定全细胞生物催化合成乙偶姻的方法，其特征在于：显色剂是按体积比1:1～2:1的比例，将质量体积浓度0.07～0.5%肌酸-NaOH溶液与质量体积浓度0.5～2% α-萘酚-NaOH溶液混合制得，其中肌酸-NaOH溶液是肌酸溶解于0.5～2 mol/LNaOH溶液中制得，α-萘酚-NaOH溶液是α-萘酚溶解于0.5～2 mol/L NaOH溶液中制得，现配现用。 3.根据权利要求1或2所述的快速测定全细胞生物催化合成乙偶姻的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）全细胞生物催化剂的制备按体积比1～4‰的比例，将产乙偶姻的能力菌接种于该能力菌生长培养基中，静置培养12～16 h；取活化好的菌液接种于液体生长培养基中，再静置培养至OD600为0.4～0.5；按10 mL/管分装培养菌液，在每管培养菌液中加入乳酸链球菌素至其终浓度为15～25 ng/mL，静置诱导4～6 h；离心收集菌体，菌体用PBS缓冲液洗涤1～2次，离心去上清后，再用24mL PBS缓冲液重悬菌体，即得全细胞生物催化剂液体；（2）全细胞生物催化合成乙偶姻的方法选自如下之一： A、取1管步骤（1）全细胞生物催化剂液体，离心收集菌体，以该菌体量为全细胞生物催化产生乙偶姻的基准菌体量；再从全细胞生物催化剂液体中分别取6 mL、3 mL、1.5 mL、0.75 mL、0.325 mL、0.1625 mL离心收集菌体，收集的菌体量为基准菌体量的1/4～1/128；另外，用MES缓冲液稀释底物α-乙酰乳酸100倍；取该底物溶液3 mL，分别加入上述离心收集的菌体中，在能力菌培养温度下转化40～60 min；将2 mL转化后反应液转移至离心管中，置于冰水浴中，用超声波细胞粉碎机破碎细胞，然后离心收集上清液，即得到全细胞生物催化产生的乙偶姻溶液； B、取步骤（1）全细胞生物催化剂液体，离心收集菌体，用PBS缓冲液重悬菌体至OD600为130～150，制得菌悬液；在60 g蒸煮大豆中加入2～3 mL菌悬液，再添加37.5～50 ng乳酸链球菌素，搅拌混匀后，置于30～40℃下发酵24 h，然后在4～5℃下后发酵24 h；称取发酵大豆10～12 g，充分研磨后转入离心管中，加入10～12 mL灭菌蒸馏水进行超声处理，离心收集上清液，残渣再加入10 mL灭菌蒸馏水超声提取1次，合并上清液，并用灭菌蒸馏水定容至25 mL，即得全细胞生物催化产生的乙偶姻溶液；（3）制备浓度在0～16 mg/L范围内的乙偶姻标准品溶液，取400 μL乙偶姻标准品溶液与4.6 mL显色剂充分混匀，25～30℃水浴显色反应40～60 min，测定OD522值，以乙偶姻浓度为横坐标，OD522值为纵坐标绘制标准曲线，制作工作曲线，得到线性回归方程；（4）乙偶姻产量检测取步骤（2）全细胞生物催化产生的乙偶姻溶液400 μL与4.6 mL显色剂充分混匀，25～30℃水浴中显色反应40～60 min，立刻在522 nm处测吸光度值；同时设置对照组，即用400μL MES缓冲液代替乙偶姻溶液进行显色反应；样品OD522值为样品测量值减去对照组测量值，然后根据步骤（3）乙偶姻标准品的线性回归方程，计算得到样品中乙偶姻含量，其中针对步骤（2）A方法选取OD522值为0.8～1.4的样品作为计算样品。 4.根据权利要求3所述的快速测定全细胞生物催化合成乙偶姻的方法，其特征在于，底物α-乙酰乳酸的制备如下：按体积比55:40:5的比例，将NaOH溶液、灭菌蒸馏水和α-乙酰氧基-α-甲基-乙酰乙酸乙酯充分混匀后，在冰水浴中反应15～20 min制得，其中NaOH溶液的浓度为0.5～2 mol/L。 5.根据权利要求3所述的快速测定全细胞生物催化合成乙偶姻的方法，其特征在于：离心收集菌体的离心是在4℃、10,000 rpm下进行10 min。 6.根据权利要求3所述的快速测定全细胞生物催化合成乙偶姻的方法，其特征在于：步骤（2）中超声波细胞粉碎机破碎细胞条件为超声温度20～25℃，超声功率316～475 W，超声程序：变幅杆Φ3 mm，超声开5～7 s，超声关3～5 s，共超声2～3 min。 7.根据权利要求3所述的快速测定全细胞生物催化合成乙偶姻的方法，其特征在于：蒸煮大豆是将大豆与蒸馏水按质量体积比1:3～1:6的比例混合，室温下浸泡12～16 h，沥干后置于加压蒸汽灭菌锅中115～121℃蒸煮30～40 min制得。 8.根据权利要求3所述的快速测定全细胞生物催化合成乙偶姻的方法，其特征在于：步骤（2）B中超声处理条件为功率200 W，工作频率53 kHz，超声时间30 min～35 min。 9.根据权利要求3所述的快速测定全细胞生物催化合成乙偶姻的方法，其特征在于：产乙偶姻的能力菌为含有α-乙酰乳酸脱羧酶基因的重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8048-ald。
所属类别：	发明专利