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原文传递一种生物膜适用的三维曲面重构方法

专利名称：	一种生物膜适用的三维曲面重构方法
摘要：	本发明涉及一种生物膜适用的三维曲面重构方法，属于生物学技术领域。主要技术方案如下：清洗与取样、固定、漂洗、脱水、透化、浸蜡与包埋、切片、粘片与烤片、脱蜡、染色、封存；调整发射光波长、调整放大倍数、拍照与图像存储；建立三维模型。本发明是针对厚度大于0.1mm的生物膜，为了避免由于生物膜过厚导致染料和激光光束无法有效进入生物膜内部而造成的表征困难提出的。使用该技术不仅能有效重构生物膜复杂的物理形态，同时保证较高的还原度，为生物膜形态变化及影响因素研究提供了切实可行的手段。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	辽宁;21
申请人：	大连大学
发明人：	韩越梅
专利状态：	有效
申请日期：	2019-03-25T00:00:00+0800
发布日期：	2019-06-14T00:00:00+0800
申请号：	CN201910225118.7
公开号：	CN109884019A
代理机构：	大连智高专利事务所(特殊普通合伙)
代理人：	李楠
分类号：	G01N21/64(2006.01);G;G01;G01N;G01N21
申请人地址：	116622 辽宁省大连市经济技术开发区学府大街10号
主权项：	1.一种生物膜适用的三维曲面重构方法，其特征在于，包括如下步骤：(一)制作生物膜切片 (1)清洗与取样 (2)固定 (3)漂洗 (4)脱水 (5)透化 (6)浸蜡与包埋 (7)切片 (8)粘片与烤片 (9)脱蜡 (10)染色 (11)封存 (二)生成光学切片 (1)调整发射光波长 (2)调整放大倍数 (3)拍照与图像存储 (三)建立三维模型。 2.如权利要求1所述的生物膜适用的三维曲面重构方法，其特征在于，包括如下步骤： (一)制作生物膜切片 (1)清洗与取样对生物膜载体采用PBS进行清洗，去除其表面和内部所含营养液，并采用工具刮取生物膜至培养皿内； (2)固定将生物膜样品固定在2.5v/v％戊二醛溶液中，并置于4℃条件下24h； (3)漂洗取出样品，用吸水纸吸去表面多余的固定液，用0.2mol/L、pH7.2的PBS磷酸盐缓冲溶液漂洗3遍； (4)脱水分别用体积浓度为用50％、75％、85％、90％和95％的乙醇溶液对样品进行脱水处理15min；再用100％乙醇处理2次，每次20min； (5)透化用0.5v/v％的TrixonX-100/PBS溶液4℃下静置10min增加细胞膜的通透性，用0.2mol/L的PBS磷酸盐缓冲溶液清洗3遍； (6)浸蜡与包埋浸蜡： 1)36℃低温浸蜡：将透化处理后的生物膜样品放入装有二甲苯的烧杯中，再逐步向烧杯中加碎蜡至过饱和，直到有石蜡析出，过夜12-24h，得到二甲苯与石蜡的混合液； 2)55-60℃高温浸蜡：将二甲苯与石蜡的混合液倒出，在烧杯中加入石蜡液，浸润5-24h后倒出石蜡液更换新的石腊液，重复此高温浸蜡步骤3遍；包埋：采用低熔点石蜡液封埋； (7)切片将石蜡包裹的生物膜样品置入包埋框中冷却，再将包埋好的蜡块进行切片，得到蜡片，蜡片的厚度在8μm-20μm范围内； (8)粘片与烤片 (9)脱蜡 (10)染色先加入PI碘化丙啶染液200μL后置于37℃下恒温震荡培养箱避光培养30min，后用PBS缓冲液清洗，吸干表面液体；再加入FITC-ConA染液200μL染色，重复恒温震荡培养和清洗； (11)封存染色后的切片经PBS缓冲液漂洗并吸干水分后，滴入抗荧光猝灭封片液放入42℃恒温箱中干燥过夜，将切片贴标签； (二)生成光学切片 (1)调整发射光波长 (2)调整放大倍数 (3)拍照与图像存储 (三)三维模型的建立将光学切片文件输入电脑，使用计算机图像处理软件对光学切片图像进行数据处理，将数据处理结果进行Z向叠加，实现基于二维图像堆叠技术的曲面重构，最后将重构的三维曲面输出，完成生物膜的曲面重构；所述的数据处理过程如下： (1)输入切片图像； (2)对图像进行灰度处理、二值处理； (3)求出图像中灰度值最小的坐标值，并记录坐标值； (4)将得到的坐标值进行筛选和处理，求出坐标值，作为绘图X、Y坐标值； (5)测量蜡片的厚度，作为Z坐标值； (6)根据X、Y、Z坐标值绘图； (7)输出三维网格图。 3.如权利要求2所述的生物膜适用的三维曲面重构方法，其特征在于，所述的PI碘化丙啶染液的配置方法如下：将1mg碘化丙啶粉末溶于1mL去离子水中形成1mg/mL的水溶液冷冻保存，使用时用PBS缓冲液将上述水溶液稀释40倍，形成浓度为25μmol/L的溶液；所述的FITC-ConA染液的配置方法如下：2mg粉末溶于0.1mol/L的NaHCO3溶液并定容至200mL，得到浓度10mg/L的溶液。 4.如权利要求2所述的生物膜适用的三维曲面重构方法，其特征在于，步骤(4)所述的筛选和处理过程如下： 1)开始； 2)X、Y分别为所求的坐标值，M、N分别为X、Y坐标值的个数； 3)X的初始值为0，M的初始值为1； 4)若M＝N＝1，那么直接输出X、Y坐标，同时X值加1； 5)若MN，则将Y的最大值与最小值相加之后除以二，求出中间值，将中间值赋予Y，然后输出X、Y坐标值； 7)结束。
所属类别：	发明专利