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原文传递检测还原型谷胱甘肽和/或氧化型谷胱甘肽的方法

专利名称：	检测还原型谷胱甘肽和/或氧化型谷胱甘肽的方法
摘要：	本发明涉及一种基于表面增强拉曼光谱技术的检测还原型谷胱甘肽(GSH)和/或氧化型谷胱甘肽(GSSG)的方法，还涉及用于检测GSH和/或GSSG的试剂盒。本发明的检测方法和试剂盒操作简便、检测速度快和灵敏度高，可以很好地应用于烷基化试剂染毒细胞样品中GSH和GSSG含量的测定，从而实现烷基化试剂快速筛查检测。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	北京;11
申请人：	中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
发明人：	吴剑峰;朱颖洁;高中才;徐华;郭磊;谢剑炜
专利状态：	有效
申请日期：	2019-03-14T00:00:00+0800
发布日期：	2019-06-14T00:00:00+0800
申请号：	CN201910192557.2
公开号：	CN109884031A
代理机构：	中国国际贸易促进委员会专利商标事务所
代理人：	苏红梅
分类号：	G01N21/65(2006.01);G;G01;G01N;G01N21
申请人地址：	100850 北京市海淀区太平路27号
主权项：	1.一种试剂盒，包括： SERS固态增强基底，和 5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)，优选地，所述SERS固态增强基底为固态纳米银基底。 2.权利要求1的试剂盒，其中还包括：PB缓冲溶液或配制PB缓冲溶液的缓冲物质(包括磷酸二氢钠、磷酸氢二钠)，和/或 PBS缓冲溶液或配制PBS缓冲溶液的缓冲物质(包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠)，可选地，所述试剂盒还包括说明书。 3.权利要求1或2的试剂盒用于检测样品中还原型谷胱甘肽(GSH)的用途。 4.一种试剂盒，包括： SERS固态增强基底， 5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)， N-乙基马来酰亚胺(NEM)，硼氢化钠，和乙酸，优选地，所述SERS固态增强基底为固态纳米银基底。 5.权利要求4的试剂盒，其中还包括：PB缓冲溶液或配制PB缓冲溶液的缓冲物质(包括磷酸二氢钠、磷酸氢二钠)，和/或 PBS缓冲溶液或配制PBS缓冲溶液的缓冲物质(包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠)，可选地，所述试剂盒还包括说明书。 6.权利要求4或5的试剂盒用于检测样品中还原型谷胱甘肽(GSH)和/或氧化型谷胱甘肽(GSSG)的用途。 7.一种试剂盒，包括： SERS固态增强基底， 5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)，和硼氢化钠，优选地，所述SERS固态增强基底为固态纳米银基底。 8.权利要求7的试剂盒，其中还包括：PB缓冲溶液或配制PB缓冲溶液的缓冲物质(包括磷酸二氢钠、磷酸氢二钠)，和/或 PBS缓冲溶液或配制PBS缓冲溶液的缓冲物质(包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠)，可选地，所述试剂盒还包括说明书。 9.权利要求7或8的试剂盒用于检测样品中氧化型谷胱甘肽(GSSG)的用途。 10.一种检测样品中还原型谷胱甘肽(GSH)的方法，包括以下操作：向待测溶液中加入5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)，孵育；将孵育后的溶液滴加到SERS固态增强基底，干燥，采集SERS图谱；可选地，判断样品中是否存在GSH，若SERS图谱在波数为约1066cm-1、约1338cm-1和/或约1558cm-1处出现特征峰，确定样品中存在GSH；优选若SERS图谱在波数为约1338cm-1处出现特征峰，确定样品中存在GSH；可选地，利用特征峰的强度对样品中的GSH进行定量。 11.一种检测样品中氧化型谷胱甘肽(GSSG)的方法，包括以下操作：向待测溶液中加入硼氢化钠，将GSSG还原为还原型谷胱甘肽(GSH)；可选地，向加入乙酸，除去过量的硼氢化钠，采用权利要求10的检测方法检测GSH，可选地，根据GSH的检测结果，判断样品中是否存在GSSH和/或计算样品中GSSH的含量。 12.一种检测样品中氧化型谷胱甘肽(GSSG)的方法，包括以下操作：向待测溶液中加入N-乙基马来酰亚胺(NEM)，掩蔽样品中还原型谷胱甘肽(GSH)的巯基，加入硼氢化钠，将GSSG还原为GSH，可选地，向加入乙酸，除去过量的硼氢化钠，采用权利要求10的检测方法检测GSH，可选地，根据GSH的检测结果，判断样品中是否存在GSSH和/或计算样品中GSSH的含量。 13.一种检测样品中还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)的比值的方法，包括以下操作：采用权利要求10的检测方法检测样品中GSH的含量，采用权利要求12的检测方法检测样品中GSSH的含量，计算GSH和GSSH的比值。 14.权利要求1、2、4、5、7、8中任一项的试剂盒或权利要求10-13中任一项的检测方法，其中所述固态纳米银基底为原位还原法制备得到的固态纳米银基底，优选地，所述原位还原法包括以下操作：将单晶硅片置于浓硫酸与双氧水的混合液中，加热，将加热后的单晶硅片用水(例如超纯水)冲洗，干燥，将干燥的单晶硅片置于HF溶液中浸泡，取出放入AgNO3和HF的混合溶液中，反应，得到固态纳米银基底，可选地，将固态纳米银基底用水(例如超纯水)冲洗，干燥，可选地，将固态纳米银基底固定于载玻片，可选地，将固态纳米银基底真空储存，优选地，所述浓硫酸与双氧水的混合液中浓硫酸与双氧水的体积比为(0.5～4):1，(1～3.5):1，(1.5～3):1或(2～2.5):1，例如1.8:1，2.1:1，2.2:1，2.3:1，2.4:1，2.8:1；优选地，加热的时间为10～20分钟，例如12分钟，15分钟，18分钟；优选地，加热的温度为50℃～90℃，例如70℃，65℃，55℃，68℃，72℃，75℃，80℃，85℃；优选地，干燥的方式为N2吹干；优选地，所述HF水溶液的质量浓度为2％～8％，例如3％，4％，5％，6％，7％；优选地，浸泡的时间为10～30分钟，例如12分钟，15分钟，18分钟，20分钟，22分钟，25分钟，28分钟；优选地，AgNO3和HF的混合溶液中AgNO3的浓度为1～4mmol L-1(例如2mmol L-1、2.5mmolL-1、3mmol L-1、3.5mmol L-1)，HF的浓度为8％～12％，例如9％，10％，11％；优选地，反应在室温下进行；优选地，反应的时间为8～12分钟，例如9分钟、10分钟、11分钟。 15.权利要求1、2、4、5、7、8中任一项的试剂盒或权利要求10-13中任一项的检测方法，其中所述固态纳米银基底为包括以下操作的方法制备得到的固态纳米银基底，制备纳米银粒子溶胶，对单晶硅片进行氢氟酸或硅烷化形式预处理，将纳米银粒子溶胶滴加到预处理后的单晶硅片上，干燥，得到固态纳米银基底，可选地，将固态纳米银基底用水(例如超纯水)冲洗，干燥(例如N2吹干)，可选地，将固态纳米银基底固定于载玻片，可选地，将固态纳米银基底真空储存，优选地，制备纳米银粒子溶胶的方法为盐酸羟胺还原硝酸银的方法；优选地，纳米银粒子的平均粒径为约1-200nm，例如：约10-100nm，约10-150nm，约30～70nm，约50-55nm，约40-60nm，约50nm；优选地，对单晶硅片进行3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTMS)预处理。 16.权利要求3、6、9中任一项的用途或权利要求10-13中任一项的检测方法，其中所述样品为生物样品(例如血液、细胞，包括但不限于动物细胞、植物细胞、真菌细胞、原生动物细胞等)或化学样品(例如药品、食品(包括固体食品、液体食品)、食品添加剂)。 17.权利要求10或12或13的检测方法，其中所述样品为细胞(例如人肺上皮细胞系(HLF))，所述待测溶液为细胞提取液，优选地，制备细胞提取液的方法包括以下操作：制备细胞悬浮液，冻融细胞悬浮液，离心，收集第一上清液，向第一上清液中加入乙腈和甲醇的混合液，混合，沉淀蛋白，收集第二上清液，即得；优选地，制备细胞悬浮液的方法包括：用PBS缓冲溶液收集细胞，离心，弃去上清液，用PBS缓冲溶液重悬细胞，得到细胞悬浮液；优选地，细胞悬浮液被冻融两次；优选地，乙腈和甲醇的混合液中乙腈和甲醇的体积比为1～5:1，例如2～4:1，例如3:1；优选地，第一上清液与乙腈和甲醇的混合液的体积比为1:1～5，例如1:2～4，例如1:3；优选地，采用涡旋混合法使第一上清液与乙腈和甲醇的混合液混合；优选地，使用离心法进行沉淀蛋白。 18.权利要求10-13中任一项的检测方法，其中滴加到SERS固态增强基底的孵育后的溶液的体积为1～10μL，例如2～9μL，3～8μL，4～7μL，5～6μL；优选地，使用便携式拉曼光谱仪采集SERS图谱，优选使用激光功率为30～60mW(例如40mW，45mW，50mW，55mW)采集SERS图谱。 19.权利要求10-13中任一项的检测方法，其中所加入的DTNB的终浓度为1-4μmol L-1，优选为2μmol L-1；优选地，所加入的NEM的终浓度为0.1～4mmol L-1，例如0.5～3.5mmol L-1，1～3mmol L-1，1.5～2.5mmol L-1，2mmol L-1；优选地，所加入的NaBH4的终浓度为4～8mmol L-1，例如4.4～7.2mmol L-1，4.8～6mmolL-1，5.2～6.4mmol L-1，5～5.4mmol L-1。
所属类别：	发明专利