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原文传递一种检测褐牙鲆卵黄原蛋白的胶体金试纸

专利名称：	一种检测褐牙鲆卵黄原蛋白的胶体金试纸
摘要：	一种检测褐牙鲆卵黄原蛋白的胶体金试纸。通过单纯的水沉淀方法从褐牙鲆卵巢匀浆液中快速纯化出卵黄脂磷蛋白，制备褐牙鲆卵黄脂磷蛋白多克隆抗体和褐牙鲆卵黄脂磷蛋白单克隆抗体，并将制备的20 nm胶体金标记到纯化的单克隆抗体上；将胶体金标记的单克隆抗体喷涂于金标垫上，将褐牙鲆卵黄脂磷蛋白多克隆抗体喷涂于硝酸纤维素膜上，在PVC板上依次贴硝酸纤维素膜、胶体金结合垫、样品垫、吸水垫，将组装好的PVC板用斩切机纵向剪切成宽度为4 mm的条状，即为检测褐牙鲆卵黄原蛋白的胶体金试纸。该试纸可在10 min之内完成褐牙鲆卵黄原蛋白的检测，为野外现场快速检测海洋环境雌激素提供重要工具。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	山东;37
申请人：	中国海洋大学
发明人：	王军;张振忠;汝少国;王蔚
专利状态：	有效
申请日期：	2019-01-25T00:00:00+0800
发布日期：	2019-06-14T00:00:00+0800
申请号：	CN201910070321.1
公开号：	CN109884312A
代理机构：	青岛海昊知识产权事务所有限公司
代理人：	张中南;邱岳
分类号：	G01N33/68(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	266100 山东省青岛市崂山区松岭路238号
主权项：	1.一种检测褐牙鲆卵黄原蛋白的胶体金试纸条，包括PVC胶板，PVC胶板表面上铺有样品垫、吸水垫、硝酸纤维素膜和结合垫；其特征在于所述的结合垫包被了金标记的褐牙鲆卵黄脂磷蛋白单克隆抗体、所述的硝酸纤维素膜包被了褐牙鲆卵黄脂磷蛋白多克隆抗体和羊抗鼠IgG抗体。 2.根据权利要求1所述的检测褐牙鲆卵黄原蛋白的胶体金试纸条，其特征在于所述的包被了胶体金标记的褐牙鲆卵黄脂磷蛋白单克隆抗体的结合垫是用以下方法制备：将褐牙鲆卵巢取出后称重，加入5倍体积4℃预冷的0.01 M PBS缓冲液混匀，在冰浴条件下使用玻璃匀浆器匀浆，5000 g离心5 min，将上清液用0.45 µm滤膜过滤后，加入10倍体积4℃预冷的超纯水，在摇床上摇晃10分钟后，5000 g离心10 min，取上清液，获得褐牙鲆卵黄脂磷蛋白纯品；取褐牙鲆卵黄脂磷蛋白纯品免疫Balb/c小鼠，取脾脏细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经三次亚克隆后获得特异性的阳性杂交瘤细胞；将2×106个/mL的阳性杂交瘤细胞腹腔注射到小鼠体内，一周后取腹水，3000 g离心10 min，收集上清，利用间接ELISA测定腹水的效价；利用Protein G亲和层析柱从腹水上清中纯化获得单克隆抗体；取1 mL的20nm胶体金，加入1 µL的0.2 M的K2CO3，同时加入16 µg单克隆抗体，反应30 min，再加入10%的BSA 110 µL封闭30 min，3000 r/min离心10 min，弃沉淀后，11000 r/min离心30 min，弃去上清，用100u L的0.01 M的PBS(PH=7.4，含5 % 的蔗糖，1 %的BSA)，将沉淀重新溶解；取一条长10 cm，宽0.5 cm的玻璃纤维膜，将上述400 µl免疫胶体金均匀地涂在该玻璃纤维膜上，于37℃干燥，塑封袋密封后，于4℃保存，即获得包被了胶体金标记的褐牙鲆卵黄脂磷蛋白单克隆抗体的结合垫。 3.根据权利要求1所述的检测褐牙鲆卵黄原蛋白的胶体金试纸条，其特征在于所述的包被了褐牙鲆卵黄脂磷蛋白多克隆抗体和羊抗鼠IgG抗体的硝酸纤维素膜是用以下方法制备：将30 cm的硝酸纤维素膜贴到PVC板上，将通过常规方法制得的褐牙鲆卵黄脂磷蛋白多克隆抗体稀释至0.8 mg/mL后，均匀喷涂到硝酸纤维素膜上的检测线位置，将市售的羊抗鼠IgG抗体稀释至6 mg/mL，均匀喷涂到硝酸纤维素膜上的质控线位置，于37℃干燥过夜，然后用塑封袋密封后，于4℃保存备用，即获得包被了褐牙鲆卵黄脂磷蛋白多克隆抗体和羊抗鼠IgG抗体的硝酸纤维素膜。 4.权利要求1所述的检测褐牙鲆卵黄原蛋白的胶体金试纸，在海洋环境雌激素类物质现场快速检测中的应用。
所属类别：	发明专利