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原文传递光镜-透射电镜联用样品处理试剂及CLEM检测方法

专利名称：	光镜-透射电镜联用样品处理试剂及CLEM检测方法
摘要：	本发明提供一种光镜‐透射电镜联用样品处理试剂，包括固定剂、包埋剂：亲水性碱性树脂GMA、硼氢化钠、细胞核荧光染料和透射电镜染料，并利用提供的光镜‐透射电镜联用样品处理试剂进行CLEM检测的方法，通过样品固定、去除背景荧光、样品脱水、渗透、包埋、聚合、超薄切片、激光共聚焦显微镜成像、透射电镜图像获取以及后期图像处理完成。本发明解决了现有方法难以兼容荧光信号和样品细胞结构的保存的问题，样品具有较强的荧光信号并能同时保留完好的超微结构信息，采用图像归一方法简单有效，可方便的将已有的荧光显微镜与透射电镜联用，以获得高一致性的光镜‐电镜联用图像，本发明结合了目标分子的定位信息及超微结构信息，非常实用。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	浙江;33
申请人：	浙江大学
发明人：	王贝贝
专利状态：	有效
申请日期：	2017-12-07T00:00:00+0800
发布日期：	2019-06-18T00:00:00+0800
申请号：	CN201711287067.8
公开号：	CN109900536A
代理机构：	杭州求是专利事务所有限公司
代理人：	赵杭丽
分类号：	G01N1/30(2006.01);G;G01;G01N;G01N1
申请人地址：	310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘路866号
主权项：	1.一种光镜-透射电镜联用样品处理试剂，其特征在于，包括固定剂、包埋剂、硼氢化钠、细胞核荧光染料和透射电镜染料。 2.根据权利要求1所述的一种光镜-透射电镜联用样品处理试剂，其特征在于，所述固定剂为2.5％戊二醛或4％多聚甲醛与0.5％戊二醛混合的固定剂；所述包埋剂为亲水性碱性树脂GMA；所述细胞核荧光染料为吖啶橙、溴化乙锭、碘化丙啶、DAPI、Hoechst染料、EthDIII、7-AAD或RedDot2中的一种；所述透射电镜染料为醋酸铀和柠檬酸铅。 3.根据权利要求2所述的一种光镜-透射电镜联用样品处理试剂，其特征在于，所述固定剂优选为2.5％戊二醛。 4.利用权利要求1所述的光镜-透射电镜联用样品处理试剂进行CLEM检测的方法，其特征在于，通过以下步骤实现： (1)样品固定：带荧光蛋白标记的样品以固定剂于4-8℃固定不少于4小时； (2)去除背景荧光：4-8℃下，步骤(1)的样品以0.5％的硼氢化钠的磷酸缓冲盐溶液处理不少于5分钟，以去除背景荧光； (3)样品脱水、渗透、包埋、聚合：4-8℃下，样品脱水、-20℃用包埋剂渗透、包埋、聚合； (4)超薄切片：样品经超薄切片机切片，以坐标铜网捞取超薄切片样品； (5)细胞核荧光染色：以细胞核荧光染料对坐标铜网上的超薄切片进行细胞核染色； (6)激光共聚焦显微镜成像：经荧光观察，在激光共聚焦显微镜下找到目标细胞结构和细胞，记录其所在的坐标铜网格的位置； (7)电子着色：经步骤(5)观察后的位于坐标铜网上的超薄切片样品以透射电镜染料染色； (8)透射电镜图像获取：以透射电镜低倍寻找到目标区域所在铜网格，以高倍拍摄其超微结构，获得其超微结构； (9)后期图像处理，利用细胞核荧光染料所标记细胞核，与透射电子显微镜下细胞核图像进行重合，同时获得目标荧光信号的定位以及超微结构信息。 5.根据权利要求4所述的CLEM的检测方法，其特征在于，其中步骤(1)所述的样品固定是将带荧光蛋白标记的样品以2.5％戊二醛于4-8℃下固定不少于4小时。 6.根据权利要求4所述的CLEM的检测方法，其特征在于，其中所述荧光蛋白为增强型绿色荧光蛋白、增强型黄色荧光蛋白、mVenus荧光蛋白中的一种。 7.根据权利要求4所述的CLEM的检测方法，其特征在于，其中步骤(3)中样品以亲水性碱性树脂GMA作为包埋剂渗透、包埋、聚合的步骤为以70％、85％、100％GMA于-20℃依次处理样品；换新的100％GMA后，于-20℃再处理60分钟；换新的100％GMA后，-20℃渗透过夜，再将样品转移至100％GMA中，以低温紫外聚合仪于-20℃聚合不少于72小时；脱水步骤为分别以50％、70％、95％乙醇于4-8℃脱水处理样品。 8.根据权利要求4所述的CLEM的检测方法，其特征在于，其中步骤(5)中以DAPI水溶液对超薄切片的细胞核进行荧光染色。 9.根据权利要求4所述的CLEM的检测方法，其特征在于，其中步骤(7)中电子着色为将激光共聚焦拍摄完毕的带铜网玻片置于清水中，划开封片剂，去除盖玻片，取出铜网，室温以4％醋酸铀染色、Reynolds’柠檬酸铅染色。 10.根据权利要求4所述的CLEM的检测方法，其特征在于，其中步骤(9)的后期图像处理为在Photoshop软件中打开荧光图像和电镜图像，新建图像，其像素高、宽度大于荧光/电镜图像的120％，依次复制粘贴电镜图像、荧光图像，成为不同图层，并进行透明化、形变处理，以细胞核为参照，进行光镜、电镜图像处理归一，同时得到EYFP所标示的荧光信号的定位以及超微结构信息。
所属类别：	发明专利