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原文传递一种快速检测犬瘟热病毒抗原的检测卡及其制备方法

专利名称：	一种快速检测犬瘟热病毒抗原的检测卡及其制备方法
摘要：	本发明涉及一种适用于国内市场的定量检测犬瘟热病毒抗原检测卡的制备方法，具体步骤为：（1）犬瘟热病毒的分离、培养、纯化；（2）抗犬瘟热病毒配对单克隆抗体的制备，包括免疫程序、细胞融合、杂交瘤筛选及克隆化、抗体制备及纯化；（3）犬瘟热病毒快速检测胶体金检测卡及其制备方法，包括样品垫处理、喷膜、C,T线确定、被测样本的处理、检测卡性能测定。本发明可以快速、灵敏、准确的定性检测国内犬瘟热病毒，克服了国内检测犬瘟热病毒胶体金检测卡开发用的配对单抗为进口原料，进口原料的单抗以某个国家分离的当前病毒制备，克服了检测过程中因地域遥远病毒变异漏检的现象。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	山东;37
申请人：	山东绿都生物科技有限公司
发明人：	武玉香;于金枝;孙珊珊;唐世云;刘捷
专利状态：	有效
申请日期：	2018-12-26T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-05T00:00:00+0800
申请号：	CN201811602771.2
公开号：	CN109975541A
代理机构：	北京智为时代知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	王加岭
分类号：	G01N33/569(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	256600 山东省滨州市滨城区黄河路二号169号
主权项：	1.一种快速检测犬瘟热病毒病原的检测卡，所述检测卡包括依次相连接的吸水垫、基膜、金标垫和样品垫，其特征在于，所述基膜上设置有C线和T线，所述C线上包被有羊抗鼠IgG的抗体，所述金标垫中含有胶体金标记的第一单克隆抗体，所述T线上包被有第二单克隆抗体；所述第一单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO: C2018146的杂交瘤细胞株分泌得到。 2.根据权利要求1所述的快速检测犬瘟热病毒病原的检测卡，所述第二单克隆抗体由保藏编号为保藏编号为CCTCC NO: C2018147的杂交瘤细胞株分泌得到。 3.权利要求1或2所述的快速检测犬瘟热病毒病原的检测卡的制备方法，包括以下步骤：步骤一，抗体制备及纯化：采用动物体内腹水诱生法制备单克隆抗体36D9和37C7；采用SPA柱法对腹水进行纯化，即得抗犬瘟热病毒单克隆抗体36D9和37C7 ；步骤二，胶体金溶液的熬制；步骤三，抗犬瘟热病毒37C7单克隆抗体的标记：每 1 ml金液先加45 微升1% K2CO3，然后再加入37C7单克隆抗体，按照每1 mL胶体金溶液加入6μg抗犬瘟热病毒单克隆抗体37C7，室温下120rpm摇30 min，加入10%牛血清白蛋白 20μL，室温下120rpm摇30 min，12000rpm离心20 min，弃上清，用0.01MPBS 溶解沉淀，即得到标记好的抗犬瘟热病毒37C7单克隆抗体标记物；步骤四，金标垫处理及胶体金膜的制备：选择聚脂纤维6613作为金标结合垫；将金标垫浸泡在处理液A中5min，处理液A为0.01M PBS，pH7.4，0.2%Triton X-100，取出37℃烘干，备用；将标记好的抗犬瘟热病毒37C7单克隆抗体标记物用划膜仪以5μL/cm的浓度喷涂在处理好的金标垫上，室温自然晾干或者37℃烘干，制成含有抗犬瘟热病毒37C7单克隆抗体标记物的胶体金膜；步骤五，样品垫处理：选择DL42为样品垫，将样品垫，浸泡在处理液B中5min，处理液B为0.01 M PBS，pH7.4，1%Triton X-100，1%BSA，0.05% NaN3，取出37℃烘干，备用；步骤六，C、T线确定：选择Sartorius CN140膜，分别将抗犬瘟热病毒36D9单克隆抗体和羊抗鼠二抗作为T线和C线划在NC膜上，浓度分别为1 mg/mL和0.6mg/mL，用划膜仪依次以1μL/cm的浓度喷涂在NC膜上， 37℃包被2h后，室温自然晾干或者37℃烘干，制成基膜；步骤七，检测卡的组装。 4.根据权利要求3所述的快速检测犬瘟热病毒病原的检测卡的制备方法，所述胶体金溶液的熬制采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，具体步骤为：量取99 mL的超纯水装入250mL的圆底烧瓶，放入搅拌子，置于磁力搅拌器上，加入1%氯金酸溶液1 mL，适当速度搅拌，打开加热开关，待溶液沸腾后迅速一次性加入1.6 mL 1%柠檬酸三钠溶液，氯金酸溶液由灰色逐渐变为酒红色，颜色稳定后继续加热10 min，待溶液冷却后，用微孔滤膜过滤，4℃保存备用，紫外扫描得到最大吸收峰为523nm的胶体金颗粒。 5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述胶体金颗粒大小为25nm。 6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述胶体金标记的抗犬瘟热病毒37C7单克隆抗体的悬浮保存液配方组成为pH 8.5的0.01MTris缓冲液，内含2%酪蛋白、1% 牛血清白蛋白、0. 5%聚乙二醇20000、0.1%叠氮钠。 7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述检测线包被时的缓冲液配方成分为pH 8.5的0.01M Tris缓冲液，内含10% 牛血清白蛋白、0. 5%聚乙二醇20000、0.1%叠氮钠；质控线包被时的缓冲液配方成分为pH 8.5的0.01M PBS缓冲液，内含10% 牛血清白蛋白、0. 5%聚乙二醇20000、0.1%叠氮钠。 8.一种快速检测犬瘟热病毒病原的测试剂盒，其包括权利要求1或2所述的一种快速检测犬瘟热病毒病原的检测卡和样本稀释液，所述样本稀释液的配方为0.9%生理盐水溶液，内含5% 牛血清白蛋白、0. 1%吐温20、0.1%叠氮钠，0.5%丙氨酸。 9.一种分泌抗犬瘟热病毒抗体的杂交瘤细胞株，所述分泌抗犬瘟热病毒抗体的杂交瘤细胞株Cdv 36D9于2018年6月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2018147，保藏地址为中国武汉-武汉大学。 10.一种分泌抗犬瘟热病毒抗体的杂交瘤细胞株，所述分泌抗犬瘟热病毒抗体的杂交瘤细胞株Cdv 37C7于2018年6月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO: C2018146，保藏地址为中国武汉-武汉大学。
所属类别：	发明专利