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原文传递高效单细胞捕获与快速单细胞分泌蛋白检测平台及检测方法

专利名称：	高效单细胞捕获与快速单细胞分泌蛋白检测平台及检测方法
摘要：	本发明公开了一种高效单细胞捕获与快速单细胞分泌蛋白检测平台及检测方法；该检测平台由单细胞捕获与液滴孵育微流控芯片、分泌蛋白捕获玻璃板、芯片夹具三部分组成；其中细胞捕获与液滴孵育微流控芯片有两层结构，分别是单细胞捕获与液滴孵育层、隔离阀层。该平台可高效快速的进行单细胞的捕获，通过隔离相的加入快速稳定的生成含有单个细胞的微液滴并可进行长期的液滴孵育，同时保证单细胞的高活性，将该芯片与分泌蛋白的检测的抗体阵列玻璃板相结合，可实现单细胞分泌蛋白高通量、快速、高灵敏度的检测。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	福建;35
申请人：	厦门大学
发明人：	杨朝勇;黄培烽;张明霞;莫诗;朱志;周雷激
专利状态：	有效
申请日期：	2019-01-29T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-09T00:00:00+0800
申请号：	CN201910083613.9
公开号：	CN109991423A
代理机构：	厦门市首创君合专利事务所有限公司
代理人：	张松亭;游学明
分类号：	G01N33/68(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	361000 福建省厦门市思明南路422号
主权项：	1.高效单细胞捕获与快速单细胞分泌蛋白检测平台，其特征在于：所述的检测平台包括细胞捕获与液滴孵育微流控芯片和分泌蛋白捕获玻璃板；其中，单细胞捕获与液滴孵育微流控芯片包括：位于上层的隔离阀层和位于下层的单细胞捕获与液滴孵育层；单细胞捕获与液滴孵育层包括多个单元，每个单元包括位于细胞流动通道左右两端的直形细胞流动通道(7)，两个直形细胞流动通道(7)之间使用U形或弧形细胞流动通道连接，还包括细胞捕获腔体(6)，所述细胞捕获腔体(6)连接有3条通道，第一条通道为细胞流动通道，连接U形或弧形细胞流动通道的一臂端，该通道的宽度大于待捕获细胞直径；第二条通道为连接通道(8)，宽度小于待捕获细胞直径，用于连接细胞捕获腔体(6)与U形或弧形细胞流动通道的另一臂端；第三条通道为检测通道(9)，检测通道(9)通向溶液通道(10)；溶液通道(10)两端分别有一个溶液入口(2)和一个溶液出口(4)；隔离阀层包括两条流动方向相反的隔离阀通道(16)，所述两条隔离阀通道分别和检测通道(9)交叉；隔离阀通道(16)和检测通道(9)之间设隔膜(29)；细胞溶液入口(1)与出口(3)在细胞流动通道两端，溶液通道两端分别有一个溶液入口(2)和一个溶液出口(4)；隔离相通道的入口(5)与细胞流动通道末端相接；分泌蛋白捕获玻璃板包括：表面修饰有多聚赖氨酸的玻璃板(26)，分泌蛋白捕获抗体阵列条带(20)修饰在玻璃板(26)上；分泌蛋白捕获抗体阵列条带(20)位于检测通道(9)内，并处于两条隔离阀通道(16)和检测通道形成的两个交叉点之间，分泌蛋白捕获抗体阵列条带(20)面向检测通道(9)并与检测通道(9)内的溶液直接接触。 2.如权利要求1所述的高效单细胞捕获与快速单细胞分泌蛋白检测平台，其特征在于：细胞流动通道、溶液通道(10)、隔离相通道(5)宽度为5-1000微米，深度为5-1000微米；检测通道宽度为5-1000微米，长度为5-1000微米，高度为5-200微米。 3.如权利要求1所述的高效单细胞捕获与快速单细胞分泌蛋白检测平台，其特征在于：一个细胞捕获腔体(6)和一个检测通道(9)组成一个孵育单元，孵育单元加上一组分泌蛋白捕获抗体条带(20)形成一个细胞分泌蛋白检测单元；分泌蛋白捕获抗体条带(20)与检测通道(9)内溶液接触。 4.如权利要求1所述的高效单细胞捕获与快速单细胞分泌蛋白检测平台，其特征在于：隔离阀通道(16)宽度为5-1000微米，高度为5-1000微米，两隔离通道间隔(14)距离为5-1000微米。 5.如权利要求1所述的高效单细胞捕获与快速单细胞分泌蛋白检测平台，其特征在于：还包括芯片夹具，所述的芯片夹具包括夹具上板和夹具下板，隔离阀层、单细胞捕获与液滴孵育层和玻璃板夹设于夹具上板和夹具下板之间。 6.如权利要求5所述的高效单细胞捕获与快速单细胞分泌蛋白检测平台，其特征在于：夹具上板开口宽度为0.1-2厘米，长度为0.1-2厘米。 7.如权利要求5所述的高效单细胞捕获与快速单细胞分泌蛋白检测平台，其特征在于：夹具上板设有螺丝固定开口(30)，以及7个芯片通道开口，分别为两个细胞通道开口、两个溶液通道开口、两个隔离阀通道开口与一个隔离相入口开口。 8.如权利要求1-7所述的高效单细胞捕获与快速单细胞分泌蛋白检测平台的应用，应用于单细胞分泌蛋白/胞内蛋白的检测和/或分析。 9.一种单细胞分泌蛋白检测方法，包括如下步骤： 1)按照权利要求1至7任一项所述的高效单细胞捕获与快速单细胞分泌蛋白检测平台的结构，制备细胞捕获与液滴孵育微流控芯片和分泌蛋白捕获玻璃板； 2)在与多聚赖氨酸捕获玻璃板热键合的修饰芯片腔体中通入捕获抗体，进行分泌蛋白捕获抗体阵列的修饰；修饰好后，使用缓冲液进行封闭，然后洗涤，最后将分泌蛋白捕获玻璃板旋干； 3)将单细胞捕获与液滴孵育微流控芯片与单细胞分泌蛋白捕获玻璃板工作区域对齐、贴合并固定；芯片浸泡在超纯水中；对单细胞进行捕获： A、先往隔离阀通道(16)内注入超纯水，使其压力变大，引起隔膜(29)向下形变，将检测通道(9)与细胞捕获腔体(6)和溶液通道(10)隔开； B、反向从隔离相入口(5)与溶液通道出口(4)通入隔离相，在细胞捕获腔体(6)中生成一个个带有单细胞的液滴； C、待液滴阵列生成后应关闭气泵开关，静置，然后将气管拔出，将隔离阀通道入口的水管拔出，释放隔离阀通道(16)压力，隔膜(29)形貌复原，不再有隔离效果，使检测通道(9)与细胞捕获腔体(6)重新连通，组成单细胞孵育单元，在将芯片的出入口使用胶带封闭； 4)将平台放入细胞培养箱中，进行细胞液滴的孵育，在整个孵育过程中单细胞处于细胞捕获腔体中，分泌蛋白通过扩散作用转移到细胞检测通道被分泌蛋白捕获抗体阵列所捕获；将经过孵育后的单细胞分泌蛋白捕获玻璃板从芯片上拆解下来，并检测单细胞分泌蛋白捕获玻璃板上的信号，分析出单细胞分泌蛋白的分泌情况。 10.如权利要求9所述的一种单细胞分泌蛋白检测方法，其特征在于：步骤(3)对单细胞进行捕获，细胞浓度控制在5105-5107/mL，细胞相与溶液相流速为0.005-0.05mL/h，反向通入隔离相时隔离相相流速为0.5-2.0mL/h，待液滴阵列生成后应关闭气泵开关，静置1-10min然后将气管拔出，将芯片的出入口使用胶带封闭。
所属类别：	发明专利