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原文传递一种同时定量检测母乳中三种抗体含量的方法

专利名称：	一种同时定量检测母乳中三种抗体含量的方法
摘要：	本发明公开了一种同时定量检测母乳中三种抗体含量的方法，采用胰蛋白酶对母乳进行酶解，选择母乳中抗体酶解产生的多肽中的特异性多肽作为标志物，人工合成该特异性多肽作为标准物质，设计并合成同位素标记的特异性多肽作为内标，采用同位素稀释液相色谱串联质谱法对特异性多肽进行定量检测，然后换算得母乳中抗体的含量。本发明能同时定量检测母乳中三种抗体含量，稳定性好、定量准确、重复性好、特异性高。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	浙江;33
申请人：	绿城农科检测技术有限公司
发明人：	陈启;郝星凯;王川丕;章舒祺;周婷婷;赵月钧
专利状态：	有效
申请日期：	2019-03-29T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-12T00:00:00+0800
申请号：	CN201910249510.5
公开号：	CN110007019A
代理机构：	杭州知见专利代理有限公司
代理人：	赵越剑
分类号：	G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	310051 浙江省杭州市滨江区长河街道滨安路688号3幢3层301室-310室
主权项：	1.一种同时定量检测母乳中三种抗体含量的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1)样品预处理母乳样品混合人工合成的同位素标记特异性多肽混标，并经胰蛋白酶酶解后得预处理液；同位素标记特异性多肽混标为同位素标记IgA特异性多肽、同位素标记IgG特异性多肽及同位素标记IgM特异性多肽的混合物；同位素标记特异性多肽混标中各同位素标记特异性多肽的浓度均为20μg/mL； IgA特异性多肽序列为：SAVQGPPER； IgG特异性多肽序列为：VVSVLTVLHQDWLNGK； IgM特异性多肽序列为：QIQVSWLR；同位素标记IgA特异性多肽序列为：SAVQGPPER；同位素标记IgG特异性多肽序列为：VVSVLTVLHQDWLNGK；同位素标记IgM特异性多肽序列为：QIQVSWLR； V代表同位素标记缬氨酸； (2)标准曲线制作取梯度浓度的人工合成的特异性多肽混标各10μL，分别加入人工合成的同位素标记特异性多肽混标10μL及980μL水；通过0.22μm滤膜后上高效液相色谱串联三重四级杆质谱检测，同时获得IgA抗体特异肽和同位素特异肽的峰面积比与对应的IgA抗体标准品溶液浓度的标准曲线、IgG抗体特异肽和同位素特异肽的峰面积比与对应的IgG抗体标准品溶液浓度的标准曲线、IgM抗体特异肽和同位素特异肽的峰面积比与对应的IgM抗体标准品溶液浓度的标准曲线； (3)色谱串联质谱分析预处理液通过0.22μm滤膜后上高效液相色谱串联三重四级杆质谱检测，得到的结果代入标准曲线，从而获得母乳样品中IgA特异性多肽、IgG特异性多肽、及IgM特异性多肽的浓度；母乳样品中IgA抗体浓度＝样品中IgA特异性多肽的摩尔浓度×IgA抗体摩尔质量×母乳样品稀释倍数/2，母乳样品中IgG抗体浓度＝样品中IgG特异性多肽的摩尔浓度×IgG抗体摩尔质量×母乳样品稀释倍数/2 母乳样品中IgM抗体浓度＝样品中IgM特异性多肽的摩尔浓度×IgM抗体摩尔质量×母乳样品稀释倍数/2。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，母乳样品混合人工合成的同位素标记特异性多肽混标，并经胰蛋白酶酶解后得预处理液得具体操作为：取母乳样品20μL，加入碳酸氢铵溶液890μL，加入人工合成的同位素标记特异性多肽混标10μL，加入二硫苏糖醇10μL，50℃反应30分钟，再加入碘代乙酰胺30μL暗处反应30分钟，加入胰蛋白酶20μL，37℃反应2小时，反应完毕后加入10％甲酸20μl终止反应，得预处理液。 3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：碳酸氢铵溶液浓度为0.1mol/L，二硫苏糖醇浓度为100mmol/L，碘代乙酰胺浓度为100mmol/L，胰蛋白酶浓度为250ug/mL。 4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，梯度浓度的人工合成的特异性多肽混标的梯度浓度设置为：1ng/ml，10ng/ml，25ng/ml，75ng/ml，100ng/ml，250ng/ml，400ng/ml，650ng/m，1000ng/ml，1500ng/ml。 5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，色谱条件如下：色谱柱为C18色谱柱，柱温为40℃；流动相A为体积百分比为0.1％的甲酸的乙腈溶液，流动相B为体积百分比为0.1％的甲酸水溶液，梯度洗脱，流速为0.3mL/min；其中，梯度洗脱为：流动相A的体积百分比由3％耗时10min上升至40％，对应地流动相B的体积百分比由97％耗时10min下降至60％，然后改为100％流动相A冲洗2min，最后改为流动相A体积百分比3％和流动相B体积百分比97％保留3min。 6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，质谱条件如下：毛细管电压：3.5kv，锥孔电压：35kv，脱溶剂温度：500℃，脱溶剂气流量：900L/min，锥孔反吹气流量：30L/hr，碰撞室压力：3.0×10-3mbar；低端分辨率1：2.5V，高端分辨率1：15.0V，离子能量1：0.5；低端分辨率2：2.8V，高端分辨率2：15.0V，离子能量2：1.0；离子源温度：150℃，提取器电压：3.0V，入口透镜电压：0.5V，出口电压：0.5V，碰撞梯度：1.0。 7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，IgA特异性多肽质谱检测时，母离子为470.7，子离子为159.1、555.3；IgG特异性多肽质谱检测时，母离子为603.3，子离子为199.1、805.4；IgM特异性多肽质谱检测时，母离子为515.3，子离子为175.1、288.2。 8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，IgA抗体特异肽和同位素特异肽的峰面积比与对应的IgA抗体标准品溶液浓度的标准曲线为y＝2.121x-0.0369，R2＝0.9993； IgG抗体特异肽和同位素特异肽的峰面积比与对应的IgG抗体标准品溶液浓度的标准曲线为y＝0.3814x+0.005，R2＝0.9927； IgM抗体特异肽和同位素特异肽的峰面积比与对应的IgM抗体标准品溶液浓度的标准曲线为y＝0.3892x+0.0068，R2＝0.9972。 9.一种同时检测母乳中三种抗体含量的试剂盒，其特征在于：包括胰蛋白酶、碳酸氢铵溶液、二硫苏糖醇、碘代乙酰胺、10％甲酸及同位素标记特异性多肽混标，同位素标记特异性多肽混标为同位素标记IgA特异性多肽、同位素标记IgG特异性多肽及同位素标记IgM特异性多肽的混合物；同位素标记特异性多肽混标中各同位素标记特异性多肽的浓度均为20μg/mL； IgA特异性多肽序列为：SAVQGPPER； IgG特异性多肽序列为：VVSVLTVLHQDWLNGK； IgM特异性多肽序列为：QIQVSWLR；同位素标记IgA特异性多肽序列为：SAVQGPPER；同位素标记IgG特异性多肽序列为：VVSVLTVLHQDWLNGK；同位素标记IgM特异性多肽序列为：QIQVSWLR； V代表同位素标记缬氨酸。
所属类别：	发明专利