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原文传递一种基于酶诱导生物刻蚀双模分离式免疫传感器及其制备方法

专利名称：	一种基于酶诱导生物刻蚀双模分离式免疫传感器及其制备方法
摘要：	本发明公开了一种基于酶诱导生物刻蚀双模分离式免疫传感器，在三维还原氧化石墨烯r‑GO表面覆盖/制备硫化镉/氧化锌纳米棒阵列CdS/ZnO NRs作为光电极；采用金纳米双锥Au NBPs作为多色显色底物；利用辣根过氧化物酶HRP连接光电化学免疫分析与比色检测，其中Cd/ZnO NRs/r‑GO通过HRP诱导的酶催化反应发生生物刻蚀，从而形成光电流变化，HRP催化氧化双氧水产生的羟基自由基用于生物蚀刻Au NBPs形成不同大小和形状的金纳米颗粒，从而显示出颜色变化和LSPR峰的蓝移，本发明方法利用脂质体通过封装大量HRP和负载更多的Ab2来有效放大响应信号，进一步提高检测的准确性。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	广东;44
申请人：	华南农业大学
发明人：	刘英菊;刘莹;魏婕;申浩然;陈华明
专利状态：	有效
申请日期：	2019-03-12T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-12T00:00:00+0800
申请号：	CN201910183819.9
公开号：	CN110006972A
代理机构：	广州嘉权专利商标事务所有限公司
代理人：	胡辉
分类号：	G01N27/327(2006.01);G;G01;G01N;G01N27
申请人地址：	510642 广东省广州市华南农业大学材料与能源学院
主权项：	1.一种基于酶诱导生物刻蚀双模分离式免疫传感器，其特征在于，采用三维还原氧化石墨烯r-GO作为光电基底，在三维还原氧化石墨烯r-GO表面覆盖/制备硫化镉/氧化锌纳米棒阵列CdS/ZnO NRs，合成的Cd/ZnO NRs/r-GO复合材料作为光电极；采用金纳米双锥AuNBPs作为多色显色底物；利用辣根过氧化物酶HRP连接光电化学免疫分析与比色检测；其中Cd/ZnO NRs/r-GO通过HRP诱导的酶催化反应发生生物刻蚀，从而形成光电流变化，HRP催化氧化双氧水产生的羟基自由基用于生物蚀刻Au NBPs形成不同大小和形状的金纳米粒子，从而显示出颜色变化和LSPR峰的蓝移。 2.根据权利要求1所述的传感器，其特征在于，所述辣根过氧化物酶HRP被脂质体包裹，形成HRP-脂质体复合物。 3.权利要求1或2任一所述的传感器的制备方法，包括以下步骤： S1.制备CdS/ZnO NRs/r-GO：先合成氧化石墨烯水凝胶(GO)，在还原氧化石墨烯r-GO上制备硫化镉/氧化锌纳米棒阵列CdS/ZnO NRs，得CdS/ZnO NRs/r-GO复合材料；制备HRP-脂质体-Ab2复合物：通过薄膜分散法制备脂质体包裹的辣根过氧化物酶HRP，得HRP-脂质体复合物，通过戊二醛交联法将HRP-脂质体复合物与第二抗体Ab2连接，得HRP-脂质体-Ab2复合物；制备金纳米双锥：运用种子生长法制备金纳米双锥Au NBPs； S2.构建双模分离式免疫传感器：通过多巴胺将抗原固定于96微孔板中上，依次加入封闭液、抗体与待测样品的混合液、HRP-脂质体-Ab2复合物的溶液、曲拉通X-100、双氧水孵化反应，将最终的反应液分为两份，一份与CdS/ZnO NRs/r-GO复合材料反应后用于PEC检测，另一份与金纳米双锥Au NBPs混合后，用于光谱检测。 4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S1所述制备CdS/ZnO NRs/r-GO的具体操作为：将160mL浓硫酸加入干燥的三口烧瓶中，在冰水浴搅拌下缓慢加入4g石墨粉和14g高锰酸钾得混合溶液A，将混合溶液A在35℃下持续搅拌24h；用400mL冰水稀释混合溶液A，然后在混合溶液A中加入双氧水直至颜色不发生改变且没有气泡产生，继续搅拌2h除去未反应的高锰酸钾，随后5000转/min离心3分钟，得沉淀物B；用300mL 1mol/L的HCl离心洗涤沉淀物B三次后，再用水洗至上清液呈中性；将沉淀物B透析一周，产物分为两等份，分别用水和乙醇离心洗涤，分别分散在水或乙醇中储存，得水溶石墨烯与醇溶石墨烯，备用；将水溶石墨烯与醇溶石墨烯等体积混合后，浸入锌片，3h后将锌片取出洗涤，浸泡在水中除去物理性吸附的石墨烯片；最后将该锌片冷冻干燥后剥离出还原氧化石墨烯r-GO膜；将还原氧化石墨烯r-GO膜浸入含有40mM硝酸锌和40mM乌洛托品的生长液中，置于烘箱中95℃下反应5h以生长氧化锌纳米棒ZnO NRs，制得ZnO NRs/r-GO；将ZnO NRs/r-GO浸入含10mM硝酸镉和10mM硫代乙酰胺的混合液中，40℃下反应40min，以3℃/min的升温速率在550℃下煅烧2h制备得CdS/ZnO NRs/r-GO复合材料。 5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S1所述通过薄膜分散法制备脂质体包裹的辣根过氧化物酶HRP的具体操作为：称取二棕榈酰磷脂酰胆碱DPPC、胆固醇和二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺DPPE共30mg，混合溶解于4mL氯仿/甲醇混合液中，得混合溶液C，其中，二棕榈酰磷脂酰胆碱DPPC、胆固醇和二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺DPPE的摩尔比为10:10:1，氯仿/甲醇混合液中，氯仿/甲醇的体积比为6:1；将混合溶液C转移至圆底烧瓶中45℃下旋转蒸发形成一层均匀的脂质薄膜，随后加入2mL含有2.5mg/mL辣根过氧化物酶HRP的PBS溶液，35℃下孵化2h，得混合物D，其中，PBS的浓度为0.01M，pH为7.4；将混合物D在冰水浴中超声5min，重复三次循环，离心洗涤除去未被包封的HRP，制备得HRP-脂质体复合物。 6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S1所述通过戊二醛交联法将HRP-脂质体复合物与第二抗体Ab2连接的具体操作为：将2mL HRP-脂质体逐滴滴入1mL戊二醛溶液中，室温下温和搅拌1h后在PBS中透析以除去过量的戊二醛，得混合物E，其中戊二醛溶液的浓度为2.5％；将50μL浓度为1mg/mL的Ab2溶液加入到混合物E中，4℃下温和搅拌12h，制得HRP-脂质体-Ab2复合物，离心洗涤后将HRP-脂质体-Ab2复合物分散于PBS中，4℃下储存备用。 7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S1所述运用种子生长法制备金纳米双锥Au NBPs的具体操作为：将0.25mL浓度为25mM的新制备的NaBH4溶液快速注入10mL包含50mM十六烷基三甲基氯化铵CTAC、0.25mM氯金酸和5mM柠檬酸的混合液F中，快速搅拌2min，将混合液F转移至80℃水浴锅中，温和搅拌90min；反应至混合液F的颜色从棕色变为红色，得金种溶液；然后，将1.25mL金种溶液加入到含有100mL浓度为100mM的十六烷基三甲基溴化铵CTAB、5mL浓度为10mM的氯金酸、1mL浓度为10mM的AgNO3、2mL浓度为1M的HCl以及0.8mL浓度为100mM的抗坏血酸的生长液中，30℃下反应2h，制备得AuNBPs。 8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S2所述构建双模分离式免疫传感器的具体操作为：将50μL浓度为1mg/mL的多巴胺滴至96微孔板中37℃下孵化30min，干燥后将20μL浓度为10μg/mL的抗原滴入孔中，孵化1h后用20μL封闭液封闭非特异性结合位点；准备20μL浓度为5μg/mL的抗体Ab1与待测样品的混合液、20μL HRP-脂质体-Ab2复合物的溶液、10μL浓度为10mg/mL的曲拉通X-100、300μL浓度为1M的双氧水、CdS/ZnONRs/r-GO复合材料以及金纳米双锥Au NBPs备用。 9.根据权利要求3至8任一所述的方法，其特征在于，所述抗原为赭曲霉毒素A，所述抗体Ab1为赭曲霉毒素A抗体。 10.一种检测赭曲霉毒素A含量的方法，采用权利要求1或2所述传感器或权利要求3至9任一所述方法制备的传感器，具体操作为：将50μL浓度为1mg/mL的多巴胺滴至96微孔板中37℃下孵化30min，干燥后将20μL浓度为10μg/mL的赭曲霉毒素A抗原滴入孔中，37℃下孵化1h后用20μL封闭液封闭非特异性结合位点；将20μL浓度为5μg/mL的赭曲霉毒素A抗体Ab1与待测样品混合，滴入微孔，37℃下孵化1h；随后将20μL HRP-脂质体-Ab2复合物的溶液滴入，37℃下孵化1h；加入10μL浓度为10mg/mL的曲拉通X-100，使脂质体包裹的HRP酶释放，再加入300μL浓度为1M的双氧水、37℃下孵化15min，得待测酶解液，取200μL待测酶解液刻蚀CdS/ZnO NRs/r-GO复合材料用于PEC检测，取100μL待测酶解液转移至包含有10μL浓度为1M的盐酸和100μL Au NBPs的混合液中，50℃下刻蚀10分钟后观察溶液的颜色变化并用紫外吸收光谱记录300-900nm范围内的峰位移。
所属类别：	发明专利