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原文传递试剂、试剂盒、血小板反应指数的测定方法及应用

专利名称：	试剂、试剂盒、血小板反应指数的测定方法及应用
摘要：	本发明涉及蛋白检测领域，具体涉及一种试剂、试剂盒、血小板反应指数的测定方法及应用。该试剂包括磷酸化VASP蛋白‑胶乳偶联物，所述磷酸化VASP蛋白‑胶乳偶联物包含经EDC和NHS活化的胶乳颗粒和磷酸化VASP蛋白单克隆抗体的偶联物，所述胶乳颗粒的粒径为100～400纳米；稳定剂；防腐剂；和缓冲液。基于上述试剂，本发明还提供了试剂盒、血小板反应指数的测定方法，以及抗血小板药物的筛选方法。通过本发明提供的试剂、试剂盒可以评估抗血小板药物药效，操作简便、成本低，特异性高。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	广东;44
申请人：	深圳优普生物技术有限公司
发明人：	杨永崧;艾峰;李印军
专利状态：	有效
申请日期：	2019-04-08T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-26T00:00:00+0800
申请号：	CN201910277401.4
公开号：	CN110058015A
代理机构：	北京清亦华知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	赵天月
分类号：	G01N33/543(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	518122 广东省深圳市坪山区坑梓街道金辉路14号深圳市生物医药创新产业园区1号楼602B
主权项：	1.一种试剂，其特征在于，包括：磷酸化VASP蛋白-胶乳偶联物，所述磷酸化VASP蛋白-胶乳偶联物包含经EDC和NHS活化的胶乳颗粒和磷酸化VASP蛋白单克隆抗体的偶联物，所述胶乳颗粒的粒径为100～400纳米，优选为300～400纳米；稳定剂；防腐剂；和缓冲液。 2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述稳定剂包括选自小牛血清白蛋白、酷蛋白、明胶、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000中的至少一种；任选地，所述稳定剂的质量体积浓度为0.5％～2.0％(w/v)；任选地，所述防腐剂包括选自叠氮钠、procline300中的至少一种；任选地，所述防腐剂的质量体积浓度为0.01％～0.04％(w/v)；任选地，所述缓冲液包括选自磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、Tris-HCl缓冲液、MOPS缓冲液中的至少一种；任选地，所述磷酸化VASP蛋白单克隆抗体至少包括两种。 3.权利要求1或2所述的试剂的制备方法，其特征在于，包括：利用EDC和NHS溶液活化胶乳颗粒，得到经EDC和NHS活化的胶乳颗粒，所述胶乳颗粒的粒径为100～400纳米，优选为300～400纳米；将磷酸化VASP蛋白单克隆抗体和所述经EDC和NHS活化的胶乳颗粒混合，偶联，获得磷酸化VASP蛋白-胶乳偶联物；将所述磷酸化VASP蛋白-胶乳颗粒偶联物和稳定剂混合，分离获得沉淀物；利用缓冲液将所述沉淀物配置成溶液，并与防腐剂混合，获得含有磷酸化VASP蛋白-胶乳偶联物的溶液。 4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，利用质量体积浓度为0.1％～0.5％(w/v)的EDC溶液和质量体积浓度为0.1％～0.5％(w/v)的NHS溶液活化所述胶乳颗粒，得到经EDC和NHS活化的胶乳颗粒；任选地，所述活化的时间为2～5小时；任选地，所述偶联温度为30～38摄氏度；任选地，所述偶联时间为2～4小时。 5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，通过离心分离得到沉淀物，所述离心速率为4000～7000rpm，所述离心时间为15～30分钟；任选地，进一步包括：将至少两种磷酸化VASP蛋白单克隆抗体和所述经EDC和NHS活化的胶乳颗粒混合，偶联，获得至少两种磷酸化VASP蛋白-胶乳偶联物。 6.一种试剂盒，其特征在于，包括：权利要求1或2所述的试剂。 7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括下列中的至少一种：激活剂，所述激活剂包括前列腺素E1；抑制剂，所述抑制剂包括前列腺素E1和二磷酸腺苷；第一试剂，所述第一试剂包括组织裂解液、缓冲液、促凝剂和表面活性剂。 8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述激活剂进一步包括缓冲盐，所述激活剂为粉剂；任选地，所述缓冲盐选自磷酸盐、碳酸盐、HEPES、Tris-HCl、MOPS中的至少一种；任选地，所述抑制剂进一步包括缓冲盐，所述抑制剂为粉剂；任选地，所述缓冲盐选自磷酸盐、碳酸盐、HEPES、Tris-HCl、MOPS中的至少一种；任选地，所述组织裂解液包括选自四癸基三甲铵溴华物、溶血素和Triton X-100中的至少一种；所述表面活性剂包括选自：吐温-20、吐温-80、Brij35、十二烷基硫酸钠、Triton X-100中的至少一种；所述促凝剂包括选自PEG4000、PEG6000、PEG8000、PEG20000中的至少一种。 9.一种利用权利要求6～8中任一项所述的试剂盒测定血小板反应指数的方法，其特征在于，包括： (1)将部分血液样本与所述激活剂混合，得到样本激活物，将所述样本激活物和所述第一试剂混合，孵育，获得第一混合溶液，在特定波长下测定所述第一混合溶液的吸光度为A1；将所述第一混合溶液和第二试剂混合，孵育，获得第二混合溶液，在特定波长下测定所述第二混合溶液的吸光度为A2；基于吸光度A2和吸光度A1的吸光度差，计算所述血液样本在激活剂作用下的磷酸化VASP蛋白浓度C激活； (2)将部分血液样本和所述抑制剂混合，得到样本抑制物，将所述样本抑制物和所述第一试剂混合，孵育，获得第三混合溶液，在特定波长下测定所述第三混合溶液的吸光度为A3；将所述第三混合溶液和第二试剂混合，孵育，获得第四混合溶液，在特定波长下测定所述第四混合溶液的吸光度为A4；基于吸光度A4和吸光度A3的吸光度差，计算所述血液样本在抑制剂作用下的磷酸化VASP蛋白浓度C抑制； (3)根据如下公式计算所述血液样本的血小板反应指数：血小板反应指数(PRI)＝[(c激活-c抑制)/c激活×100％]；其中所述第二试剂为权利要求1或2所述的试剂，所述特定波长为500～580纳米，优选为540～570纳米；任选地，所述血液样本为全血样本。 10.一种抗血小板药物的筛选方法，其特征在于，包括：取受试者的血液样本，对受试者给予候选药物治疗，分别取受试者在治疗前和治疗后的血液样本，依照权利要求9所述的方法计算所述血样样本的血小板反应指数；其中给予候选药物治疗后所述受试者的血液样本的血小板反应指数降低的所述候选药物作为抗血小板药物。
所属类别：	发明专利