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原文传递一种mHPBs-Hemin/rGO标记的电化学免疫传感器的制备方法及应用

专利名称：	一种mHPBs-Hemin/rGO标记的电化学免疫传感器的制备方法及应用
摘要：	本发明属于新型纳米材料、免疫分析和生物传感检测技术领域，提供了一种mHPBs‑Hemin/rGO标记的电化学免疫传感器的制备方法及应用。本发明首次将介孔空心的普鲁士蓝纳米立方间隔的氯高铁血红素功能化石墨烯多孔复合材料作为电流信号放大机制引入电化学免疫传感器的构建中，高效放大电流响应信号，实现黄曲霉毒素的定量、灵敏检测。本发明的电化学免疫传感器操作简便，成本低，灵敏度高，检测范围广，对黄曲霉毒素的定量、灵敏检测有重要的科学意义和应用价值。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	山东;37
申请人：	山东理工大学
发明人：	李月云;张春燕;禹晓东;张栓;贾翌雷;李新进;徐振
专利状态：	有效
申请日期：	2019-04-24T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-26T00:00:00+0800
申请号：	CN201910333993.7
公开号：	CN110057892A
分类号：	G01N27/327(2006.01);G;G01;G01N;G01N27
申请人地址：	255086 山东省淄博市高新技术开发区高创园A座313室
主权项：	1.一种mHPBs-Hemin/rGO标记的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将直径为4.0 mm的玻碳电极用氧化铝粉末抛光成镜面，在超纯水中超声清洗干净；（2）取6.0 µL的MUA-Au NPs滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水清洗电极表面，晾干；（3）继续将6.0 µL、10.0 ~ 20.0 µg/mL的黄曲霉毒素捕获抗体Ab1滴加到电极表面，置于4.0 °C冰箱中晾干；（4）将3.0 µL、0.5 ~ 1.5%的牛血清蛋白BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，用pH=7.2的磷酸盐缓冲液清洗电极表面，置于4.0 °C冰箱中晾干；（5）滴加6.0 µL、1.0 pg/mL ~ 100.0 ng/mL的一系列不同浓度的黄曲霉毒素抗原溶液，置于4.0 °C冰箱中30.0 ~ 40.0 min后，用pH=7.2的磷酸盐缓冲液清洗，置于4.0 °C冰箱中晾干；（6）滴加6.0 µL、0.5 ~ 2.5 mg/mL的mHPBs-Hemin/rGO标记的黄曲霉毒素抗体mHPBs-Hemin/rGO-Ab2置于4.0 °C冰箱中30.0 ~ 40.0 min后，用pH=7.2的磷酸盐缓冲液清洗，置于4.0 °C冰箱中晾干，得到一种mHPBs-Hemin/rGO标记的电化学免疫传感器。 2. 如权利要求1所述的一种mHPBs-Hemin/rGO标记的电化学免疫传感器的制备方法，所述MUA-Au NPs的制备，其特征在于，包括以下步骤：取99.0 mL的超纯水加入500 mL三口烧瓶中，继续加入0.5 ~ 1.5 mL、质量分数为1.0%的氯金酸溶液，在磁力搅拌下，100 ℃油浴加热15.0 ~ 25.0 min后，加入1.5 ~ 3.5 mL、质量分数为1.0%的柠檬酸钠溶液，继续100 ℃油浴加热10.0 ~ 20.0 min，冷却至室温，制得Au NPs；取1.0 ~ 2.0 mL的Au NPs在12000 rpm下离心20 min，在沉淀物中加入1.0 ~ 2.0 mL超纯水，超声5.0 ~ 10.0 min，得到Au NPs分散液A；向0.5 ~ 1.0 mL超纯水中加入0.05mL、15.0 ~ 25.0 mmol/L的11-巯基十一烷酸MUA乙醇溶液，超声60 min，得到溶液B；将溶液B缓慢加入到Au NPs分散液A中，在室温下震荡2.0 ~ 4.0 h，得到的溶液在9000 rpm下离心30 min，制得MUA-Au NPs。 3. 如权利要求1所述的一种mHPBs-Hemin/rGO标记的电化学免疫传感器的制备方法，所述mHPBs-Hemin/rGO-Ab2的制备，其特征在于，包括以下步骤：（1）mHPBs的制备将1.0 ~ 5.0 g聚乙烯吡咯烷酮和100.0 ~ 160.0 mg铁氰化钾在磁力搅拌下加入20.0~ 60.0 mL、0.1 mol/L的盐酸溶液中，继续磁力搅拌20.0 ~ 40.0 min，将得到的清澈溶液在80.0 ℃下反应16.0 ~ 24.0 h后，在10000 rpm下离心5 min，得到的沉淀用无水乙醇和超纯水分别洗涤三次，室温下干燥12.0 h，制得介孔普鲁士蓝种子；取1.0 ~ 5.0 g聚乙烯吡咯烷酮、100.0 ~ 160.0 mg铁氰化钾和5.0 ~ 15.0 mg的介孔普鲁士蓝种子在磁力搅拌下加入20.0 ~ 60.0 mL、0.01 mol/L的盐酸溶液中，继续磁力搅拌20.0 ~ 40.0 min，将混合液体在80 ℃下反应10.0 ~ 14.0 h后，在10000 rpm下离心5min，得到的沉淀用无水乙醇和超纯水分别洗涤三次，室温下干燥12.0 h，制得介孔普鲁士蓝mPBs；称取50.0 ~ 150.0 mg聚乙烯吡咯烷酮和15.0 ~ 25.0 mg的mPBs在磁力搅拌下加入15.0 ~ 25.0 mL、1.0 mol/L的盐酸溶液中，继续磁力搅拌1.0 ~ 3.0 h，将上述混合液体转移到聚四氟乙烯高压反应釜中，140 ℃下保温3.0 ~ 5.0 h后，在10000 rpm下离心5 min，得到的沉淀用无水乙醇和超纯水分别洗涤三次，制得介孔空心普鲁士蓝纳米立方mHPBs；（2）mHPBs-Hemin/rGO的制备取5.0 ~ 10.0 mg氯高铁血红素Hemin和5.0 ~ 10.0 g二氨基吡啶溶解于50.0 ~100.0 mL、1.0 mg/mL的氧化石墨烯GO溶液中，超声分散20.0 ~ 40.0 min，继续加入10.0mL、5.0 ~ 15.0 mg/mL的mHPBs溶液，磁力搅拌2.0 h，将上述混合液体转移到聚四氟乙烯高压反应釜中，130 ℃下保温3.0 ~ 5.0 h后，在8000 rpm下离心10 min，将沉淀物移入50 mL培养皿中，在-20.0 ℃冰箱中冷冻12 h后，放入冷冻干燥机中，-80.0 ℃下冷冻干燥后，制得mHPBs-Hemin/rGO；（3）mHPBs-Hemin/rGO-Ab2的制备取2.0 ~ 12.0 mg的mHPBs-Hemin/rGO加入2.0 mL的pH=7.2的磷酸盐缓冲溶液中，超声10.0 ~ 20.0 min后，将上述混合液体加入2.0 mL、20.0 µg/mL的黄曲霉毒素抗体溶液中，置于4.0 °C恒温振荡器中振荡8.0 ~ 12.0 h，制得mHPBs-Hemin/rGO-Ab2，4.0 °C冰箱中保存备用。 4.如权利要求1所述的一种m-HPBs-Hemin/rGO标记的电化学免疫传感器，应用于黄曲霉毒素的检测，步骤如下：（1）使用电化学工作站，以饱和甘汞电极为参比电极，以铂丝电极为对电极，与所制备的传感器为工作电极构成三电极系统，在10.0 mL的pH=5.91 ~ 7.73磷酸盐缓冲溶液中进行测试；（2）用时间-电流法在初始电位为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间为400.0 s；（3）当背景电流稳定后，向10.0 mL、pH=7.2磷酸盐缓冲溶液中注入10.0 μL、5.0 mol/L的H2O2，电流再次稳定后，记录电流的变化；（4）采用不同浓度的黄曲霉毒素抗原进行测定，记录不同浓度黄曲霉毒素抗原所对应的电流值变化；（5）利用工作曲线法，得到待测样品中黄曲霉毒素抗原的浓度。 5.如权利要求1、3和4所述的黄曲霉毒素，其特征在于，所述黄曲霉毒素为AFB1。
所属类别：	发明专利