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原文传递基于SDA的电化学发光适配体传感器及其三价砷离子的检测方法

专利名称：	基于SDA的电化学发光适配体传感器及其三价砷离子的检测方法
摘要：	本发明涉及一种三价砷离子的基于SDA的电化学发光适配体传感器，及利用该传感器进行三价砷离子检测的检测方法，所述传感器包括发夹DNA、负载发夹DNA的聚多巴胺纳米球、识别三价砷离子的适配体以及与适配体杂交的cDNA；所述发夹DNA的序列为：5'‑GCTGTAATACCAGCTTAT TCAACCTCAGCTTCGATATTTGTTATCGAAGC‑3'；cDNA的序列为5'‑TTGAATAAGCTGGTATTACAGC‑3'；本发明传感器中的发夹DNA可以省去引物‑模板比例的调节，确保有效的DNA扩增，另外，在ECL检测时可以避免电极的处理和探针的固定。
专利类型：	发明专利
申请人：	福建中医药大学
发明人：	许惠凤;朱希;张诗琪;余丽双;叶蕻芝;王丽丽
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T16:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T00:00:00+0805
申请号：	CN202010048476.8
公开号：	CN111077198A
代理机构：	北京中济纬天专利代理有限公司
代理人：	张磊
分类号：	G01N27/26;G01N27/30;G01N27/327;G;G01;G01N;G01N27;G01N27/26;G01N27/30;G01N27/327
申请人地址：	350122 福建省福州市闽侯县上街镇大学城邱阳路1号
主权项：	1.一种三价砷离子的基于SDA的电化学发光适配体传感器，其特征在于：它包括发夹DNA、负载发夹DNA的聚多巴胺纳米球、识别三价砷离子的适配体以及与适配体杂交的cDNA；其中，所述发夹DNA的序列为： 5'-GCTGTAATACCAGCTTATTCAACCTCAGCTTCGATATTTGTTATCGAAGC-3'；其3'端的TTCGATATTTGTTATCGAAGC为引发聚合反应的引物链区域，将折叠成发夹结构；其中间区域序列CCTCAGC包含Nicking核酸内切酶的识别位点；其5'端的序列GCTGTAATACCAGCTTATTCAA为单链结构域，是后续链置换过程的模板；所述cDNA的序列为5'-TTGAATAAGCTGGTATTACAGC-3'；cDNA与发夹DNA的单链结构域可杂交形成双链发夹结构；所述适配体的序列为： 5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATTTTACAGAACAACCAACGTCGCTCCGGGTACTTCTTCATCGAGATAGTAAGTGCAATCT-3'。 2.一种利用权利要求1所述的电化学发光适配体传感器进行三价砷离子检测的检测方法，其特征在于：它包括以下步骤： 1)配制溶液：利用二次蒸馏水分别溶解发夹DNA、cDNA、适配体、聚多巴胺纳米球、DNA聚合酶、Nicking核酸内切酶、dNTPs混合物以及Ru(phen)32+得到对应物质的水溶液； 2)制备反应液： a.将等浓度的cDNA水溶液与适配体水溶液分别在95℃下保持5min，然后以0.1℃/s的速率退火至25℃，之后将退火后的cDNA水溶液与退火后的适配体水溶液等体积混合后，加入Tris-醋酸缓冲液；之后加入待测液，并在37℃下孵育30min； b.将发夹DNA水溶液在95℃下保持5min，然后以0.1℃/s的速率退火至25℃，之后，加入PDANS水溶液，并在37℃下孵育30min； c.将步骤b反应所得的溶液加入步骤a的溶液体系中，继续孵育30min；随后加入DNA聚合酶水溶液、Nicking核酸内切酶水溶液、dNTPs水溶液，再在37℃下再孵育1.5h；之后，将反应后所得的混合液进行4000rpm离心，再在搅拌下将Ru(phen)32+水溶液加入上清液中，得反应液； 3)ECL检测：将步骤2)所得的反应液倒入含有TPA的Tris-醋酸缓冲液中，得测试溶液，将ECL检测时所用的三电极系统浸入测试溶液中进行ECL检测，根据ECL检测时的ECL强度，实现对三价砷离子的定性定量检测；其中，所述发夹DNA、cDNA以及适配体如权利要求1所述；所述Nicking核酸内切酶为Nb.BbvCI。 3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述发夹DNA水溶液的浓度为1μM。 4.根据权利要求2所述的检测的方法，其特征在于：所述cDNA水溶液的浓度为5nM；所述适配体水溶液的浓度为5nM；所述聚多巴胺纳米球水溶液的浓度为90μg/mL。 5.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述DNA聚合酶水溶液的浓度为10U/μL。 6.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述Nicking核酸内切酶水溶液的浓度为7U/μL。 7.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述Ru(phen)32+水溶液的浓度为40μM。 8.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：步骤3)中进行ECL检测时，ECL分析仪的光电倍增管(PMT)在800V电压下运行；将三电极系统浸入测试溶液中，并通过扫描将电势范围设置为速率为100mV/s。 9.一种三价砷离子的电化学发光检测试剂盒，其特征在于：它包括发夹DNA、cDNA、适配体、聚多巴胺纳米球、DNA聚合酶、Nicking核酸内切酶、dNTPs混合物、Ru(phen)32+、二次蒸馏水、Tris-醋酸缓冲液以及三丙胺；其中，所述发夹DNA、cDNA以及适配体如权利要求1所述；所述Nicking核酸内切酶为Nb.BbvCI。 10.根据权利要求9所述的三价砷离子的电化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述DNA聚合酶为exo-Klenow。
所属类别：	发明专利