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原文传递一种杜拉鲁肽的竞争ELISA的检测方法及其试剂盒

专利名称：	一种杜拉鲁肽的竞争ELISA的检测方法及其试剂盒
摘要：	本发明涉及一种杜拉鲁肽的竞争ELISA的检测方法及其试剂盒，具有特异性好、操作简单快速及可进行高通量检测的优点。该方法以小鼠抗人GLP‑1单抗为捕获抗体，以杜拉鲁肽和生物素化杜拉鲁肽竞争结合来定量分析，具有背景信号小、定量范围宽的特点，能够减少样品稀释步骤带来的误差。
专利类型：	发明专利
申请人：	烟台大学
发明人：	王文艳;董莉娜;朱丽萌;刘万卉
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T14:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T08:00:00+0805
申请号：	CN202010093700.5
公开号：	CN111122880A
分类号：	G01N33/74;G01N33/58;G01N33/577;G01N33/543;G01N33/532;G;G01;G01N;G01N33;G01N33/74;G01N33/58;G01N33/577;G01N33/543;G01N33/532
申请人地址：	264005 山东省烟台市莱山区清泉路32号烟台大学
主权项：	1.一种杜拉鲁肽的竞争ELISA的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）用小鼠抗人GLP-1抗体作为捕获抗体包板，（2）加入杜拉鲁肽和生物素化的杜拉鲁肽进行竞争结合，（3）加入链霉素标记的辣根过氧化物酶，（4）通过酶和底物进行显色反应，测定吸光度。 2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述酶和底物的显色反应是指：加入底物四甲基联苯胺，在HRP的催化作用下变为蓝色，在酸的作用下变为黄色，和/或所述检测方法用于检测血清中杜拉鲁肽浓度。 3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，小鼠抗人GLP-1抗体的包板浓度为1-5μg/mL，和/或血清的稀释度为1:1-10，和/或链霉素标记的辣根过氧化物酶的稀释度为1:500-5000，和/或封闭液为0.5%-5%BSA/PBS，和/或稀释液为0.05-1%BSA/PBST，和/或反应时间为0.5-3h，和/或反应温度为30-40℃，和/或转速为300-400rpm。 4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，小鼠抗人GLP-1抗体的包板浓度为2μg/mL，和/或血清的稀释度为1:5，和/或链霉素标记的辣根过氧化物酶的稀释度为1:1500，和/或封闭液为1%BSA/PBS，和/或稀释液为0.1%BSA/PBST，和/或反应时间为1h，和/或反应温度为37℃，和/或转速为350rpm。 5.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述血清为恒河猴血清。 6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述生物素化的杜拉鲁肽通过如下方法制备：（1）用PBS稀释杜拉鲁肽，将代标记的抗原在碳酸氢钠溶液中超滤；（2）称取生物素配置成溶液，且杜拉鲁肽按照2-50倍摩尔过量的生物素标记；（3）将完成标记反应的杜拉鲁肽溶液超滤，定容；同时加入终产物体积5%-25%的1%-5%BSA和终产物体积20%-80%的甘油并测定浓度。 7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述生物素化的杜拉鲁肽通过如下方法制备：（1）用PBS将杜拉鲁肽稀释至2mg/mL，并取0.5mL置于冰盒上待用；将代标记的抗原转移至10MW的超滤管中并在0.1M的碳酸氢钠溶液中超滤3次，转速为12000r/min，时间为10min；（2）精密称取1mg生物素并加入180μL的超纯水配置成10mM的溶液，避光放置且杜拉鲁肽按照10倍摩尔过量的生物素标记；混匀后放入到不透光的袋子中，标记过程于冰盒上并静置2小时；（3）将完成标记反应的杜拉鲁肽溶液通过10MW超滤管用PBS超滤3次，并将超滤管中的抗体通过PBS定容到合适的体积，此体积占终体积的40%；同时加入终产物体积10%的2%BSA和终产物体积50%的甘油，涡旋混匀；并使用Nanodrop在280nm处测定浓度。 8.一种用于竞争ELISA检测杜拉鲁肽的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中含有生物素化的杜拉鲁肽。 9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述生物素化的杜拉鲁肽的制备权利要求6或7中任一项的制备方法制备。 10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述生物素化的杜拉鲁肽的浓度为1-100ng/mL。
所属类别：	发明专利