详情

原文传递一种人Legumain化学发光检测试剂盒及其应用

专利名称：	一种人Legumain化学发光检测试剂盒及其应用
摘要：	一种人Legumain化学发光检测试剂盒及其应用，所述试剂盒包括以下组分：a）链霉亲和素化磁珠悬浮液；b)吖啶酯标记的Legumain抗体；c)生物素标记Legumain抗体；d）化学发光底物液，包括A液和B液，所述A液为硝酸溶液，B液为氢氧化钠溶液；e)校准品：浓度为0pg/mL，10pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL、2500pg/mL的Legumain抗原；f）质控品；g)清洗液。本试剂盒以链霉亲和素化磁珠悬浮液作为免疫反应与分离的固相载体，亲和素化的磁性微粒子主要用于与生物素标记的抗体相连，通过免疫反应使其能够捕获靶物质形成免疫复合物。
专利类型：	发明专利
申请人：	南京拂晓生物科技有限公司
发明人：	李伟;赵树杰
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T09:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T15:00:00+0805
申请号：	CN202010023027.8
公开号：	CN111157725A
代理机构：	北京中建联合知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	旦帅男;王灵灵
分类号：	G01N33/574;G01N33/543;G;G01;G01N;G01N33;G01N33/574;G01N33/543
申请人地址：	210046 江苏省南京市栖霞区红枫科技园C3栋第二层
主权项：	1.一种人Legumain化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下组分：链霉亲和素化磁珠悬浮液；吖啶酯标记的Legumain抗体；生物素标记Legumain抗体；化学发光底物液，包括A液和B液，所述A液为硝酸溶液，B液为氢氧化钠溶液；校准品：浓度为0 pg/mL，10 pg/ mL、50 pg/mL、100 pg/mL、500 pg/mL、1000 pg/mL、2500 pg/mL的Legumain抗原；质控品；清洗液。 2. 如权利要求1所述的一种人Legumain化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述吖啶酯标记的Legumain抗体由以下步骤制备而成：将Legumain抗体放入离心管中室温离心10s～30s，离心后加入碳酸缓冲液，混匀后加入吖啶酯溶液再次进行室室温离心，离心后将离心管密封后放入避光暗盒中，然后将暗盒放入气浴恒温振荡器中混匀，25℃震荡混匀2 -4h，混匀后在离心管中加入封闭液，再次将暗盒放入气浴恒温振荡器中混匀封闭，封闭时间1-2h，将封闭好的抗体上葡聚糖凝胶G250柱纯化、用 PB缓冲液洗脱，收集，然后放入缓冲液中稀释，保存吖啶酯标记的Legumain抗体备用。 3. 如权利要求2所述的一种人Legumain化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述吖啶酯标记的Legumain抗体中Legumain抗体的质量(μg)：吖啶酯溶液的体积(μl)为100﹕1，所述吖啶酯溶液浓度为2mg/mL，所述封闭液为20％的赖氨酸；所述缓冲液为50mM MES、0.05％吐温-20和0.05％ Proclin300的混合液，pH = 6。 4.如权利要求1所述的一种人Legumain化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述链霉亲和素化磁珠悬浮液由以下步骤制备而成： 1) 将氯化铁和氯化亚铁在水中溶解混匀后，加入氨水，在50-70℃下反应3-5h，得到磁性微球； 2) 将步骤1)得到的磁性微球分散于50％乙醇中，之后同0.5％ PEG4000、0.1％氨水和0.1％正硅酸乙酯在60-65℃搅拌反应 14h-18h，得到改性后的磁性微球； 3) 将步骤2) 得到的改性后的磁性微球用超纯水和无水乙醇交替洗涤后重悬于 50％乙醇中，再分别加入0.05％氨水、0.5％四甲基氢氧化铵TMA和2.5％ 3－氨丙基三甲氧基硅烷，在室温搅拌反应14h-18h，得表面修饰氨基的磁性微球； 4) 将步骤3) 得到表面修饰氨基的磁性微球用PBS缓冲液清洗并重悬再加入0.1％TMA、 2.5％戊二醛在室温下搅拌反应30-40min，之后用碳酸缓冲液清洗并重悬超声分散后按 20ug/mg磁性微球加入SA，37℃搅拌反应14h-18h，加入0.1％谷氨酸和1％BSA继续反应1- 2h，反应后，利用含0.05％的Tween-20的PBS缓冲液洗涤3次后重悬于1％BSA中超声分散即得SA磁性微球，加入磁微粒保存液于2～8℃保存，得到链霉亲和素化磁珠得到链霉亲和素化磁珠悬浮液备用。 5. 如权利要求1所述的一种人Legumain化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述生物素标记Legumain抗体由以下步骤制备而成：利用 pH6.5的Tris缓冲液将Legumain抗体透析纯化后，加入已活化的长链磺化生物素，2 - 8℃反应1-3h，再转入室温继续反应10-30min，最后加入赖氨酸反应10 -30min，经纯化，加入等体积甘油和0.1% NaN 3或0.1%Proclin300，得到偶联标记物标记的Legumain抗体。 6.如权利要求4所述的一种人Legumain化学发光检测试剂盒，其特征在于，步骤1）中氯化铁和氯化亚铁摩尔比为2﹕1；步骤2）的PEG4000、氨水和正硅酸乙酯的体积比为1﹕5﹕1；步骤3）的氨水、四甲基氢氧化铵TMA和3-氨丙基三甲氧基硅烷的体积比为5﹕2﹕4；步骤4）中TMA、戊二醛、SA、谷氨酸、BSA的体积比为2﹕3﹕10﹕1﹕1。 7. 如权利要求1所述的一种人Legumain化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述链霉亲和素化磁珠悬浮液中磁珠的粒径为0.05～3μm；所述吖啶酯标记的Legumain抗体中吖啶酯与Legumain抗体的摩尔比为1﹕(3～20)；所述生物素标记Legumain抗体中生物素与Legumain抗体的摩尔比为 1﹕(5～20)；所述清洗液为PB缓冲液。 8.如权利要求1所述的一种人Legumain化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述校准品由以下方法制备而成： 1）由0.1mol/L的PB、0.15mol/L的氯化钠、1％的牛血清白蛋白及0.05％的Tween-20混合形成校准品缓冲液，pH = 6.5，2-8℃存放备用； 2）取Legumain抗原用1）步所得校准品缓冲液分别配制成浓度为0 pg/mL，10 pg/mL、50 pg/mL、100 pg/mL、500 pg/mL、1000 pg/mL、2500 pg/mL的校准品，等量分装呈7瓶校准品。 9.如权利要求1所述的一种人Legumain化学发光检测试剂盒的应用，其特征在于：所述试剂盒在检测人Legumain的产品中的应用。 10.如权利要求1所述的一种人Legumain化学发光检测试剂盒的应用，其特征在于：所述试剂盒用于早期卵巢癌诊断。
所属类别：	发明专利