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原文传递一种改良的微载体活细胞荧光染色方法

专利名称：	一种改良的微载体活细胞荧光染色方法
摘要：	本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种利用微载体技术培养细胞的活细胞荧光染色方法，用来鉴定微载体上细胞的活性。本发明在染色前加入细胞膜通透剂triton X‑100以增强细胞通透性，促进染料进入细胞内与核酸结合；染色时，采用无血清培养基作为缓冲液，配制钙黄绿素‑乙酸甲基酯(Caclein‑AM)活细胞染色液，更接近细胞生长环境，防止细胞脱落；染色后，加入抗荧光衰减剂DABCO即1,4‑二偶氮双环[2,2,2]‑辛烷，有效延长发荧光的时间，从而使检测结果更精准。使用该方法可以根据发绿色荧光的强度判断出微载体上贴壁细胞的活性大小，同时不影响细胞的生长。
专利类型：	发明专利
申请人：	浙江卫未生物医药科技有限公司
发明人：	陈锦阳;李静静;刘军权
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T13:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T19:00:00+0805
申请号：	CN202010033848.X
公开号：	CN111175112A
代理机构：	北京卓岚智财知识产权代理事务所(特殊普通合伙)
代理人：	郭智
分类号：	G01N1/30;G;G01;G01N;G01N1;G01N1/30
申请人地址：	310000 浙江省杭州市长河街道秋溢路288号2幢2层201室
主权项：	1.一种新的微载体活细胞荧光染色方法，主要包括以下步骤： (1)取2ml左右贴壁状态良好的微载体细胞悬液，去掉培养基，用无菌DPBS轻轻清洗1～2次，弃掉DPBS洗涤液； (2)配制活细胞荧光染色液：取10ul Caclein-AM原液加入到1ml无血清培养基中，混合均匀； (3)向洗涤好的微载体中加入刚刚制备好的活细胞荧光染色液进行染色，室温孵育10～30min； (4)染色完成后，加入1ml抗荧光衰减剂DABCO； (5)将孵育好的微载体放在荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜及其配套的活细胞工作站下进行观察拍照。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的微载体为国产或者进口的球形或片状等其他类型的微载体材料，专门用于贴壁细胞的培养。 3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中细胞清洗液为DPBS，也可以为PBS、生理盐水或无血清培养基。 4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的细胞为原代或传代培养的干细胞或其他种类的细胞。 5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的无血清培养基为培养该细胞的基础培养基(不含血清)。 6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中的Caclein-AM原液为浓度为4mM Caclein-AM的DMSO溶液。 7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中的染色液必须是现配现用，因为Caclein-AM对湿度非常敏感，Caclein-AM水溶液不稳定。 8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中的染色液的孵育时间为10～30min。 9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(4)中的抗荧光衰减剂为DABCO即1,4-二偶氮双环[2,2,2]-辛烷，其质量浓度通常为0～1.0％。 10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该种活细胞荧光染色方法适用于但不仅限于微载体培养的贴壁细胞。
所属类别：	发明专利