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一种HPLC-MS/MS法测定犬血浆中Rutin和Ombuoside的浓度的方法
| 专利名称： | 一种HPLC-MS/MS法测定犬血浆中Rutin和Ombuoside的浓度的方法 |
| 摘要： | 本发明公开了一种HPLC‑MS/MS法测定犬血浆中Rutin和Ombuoside的浓度的方法，包括以下步骤，(1)校正标示样的配置，质控样品的配置；(2)样品处理；(3)标准曲线的制作；(4)定量分析：根据步骤(2)对待测样品进行处理，并按照步骤(3)所得所述标准曲线计算得到所述待测样品中的Rutin、Ombuoside的浓度。应用HPLC‑MS/MS(高效液相质谱)法同时测量犬血浆中Rutin和Ombuoside的浓度，该测试方法的准确度高，基质效应的影响小，干扰性小，回收率高。 |
| 专利类型： | 发明专利 |
| 申请人： | 安领生物医药(苏州)有限公司 |
| 发明人： | 王樱桃;胡玲华 |
| 专利状态： | 有效 |
| 申请日期： | 1900-01-20T00:00:00+0805 |
| 发布日期： | 1900-01-20T22:00:00+0805 |
| 申请号： | CN201911420882.6 |
| 公开号： | CN111189936A |
| 代理机构： | 苏州隆恒知识产权代理事务所(普通合伙) |
| 代理人： | 周子轶 |
| 分类号： | G01N30/02;G01N30/04;G01N30/06;G01N30/34;G01N30/36;G01N30/72;G;G01;G01N;G01N30;G01N30/02;G01N30/04;G01N30/06;G01N30/34;G01N30/36;G01N30/72 |
| 申请人地址： | 215000 江苏省苏州市工业园区金鸡湖大道99号11栋504室 |
| 主权项： | 1.一种HPLC-MS/MS法测定犬血浆中Rutin和Ombuoside的浓度的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1)储备液的配置：对Rutin、Ombuoside和Osalmide各取1.00mg/mL，并且分别用甲醇溶解，配置得到Rutin储备液、Ombuoside储备液和Osalmide储备液，≤-15℃密闭，遮光保存，其中Osalmide作为内标； 校正标示样品工作液的配置：将所述Rutin储备液和所述Ombuoside储备液分别用甲醇-水溶液稀释成浓度为4*105、3.2*105ng/mL的所述校正标示样品工作液，将等浓度的所述Rutin和所述Ombuoside混合再用甲醇-水溶液稀释成梯度浓度400～8*104ng/mL的所述校正标示样品工作液； 质控工作液的配置：将所述Rutin储备液和所述Ombuoside储备液分别用甲醇-水溶液稀释成浓度为3*105ng/mL的质控工作液，将等浓度的所述Rutin和所述Ombuoside混合再用甲醇-水溶液稀释成梯度浓度400～2*105ng/mL的所述质控工作液； 内标工作液的配置：将所述Osalmide储备液用甲醇-水溶液稀释成浓度为200、50ng/mL的所述内标工作液； 校正标示样的配置：将所述校正标示样品工作液用空白基质稀释成梯度浓度为20～2*104ng/mL的所述校正标示样，所述空白基质为不含所述分析物与所述内标的犬血浆； 质控样品的配置：将所述质控工作液用所述空白基质稀释成浓度为20～1.5*104ng/mL的所述质控样品； (2)样品处理：取等体积的所述校正标示样和所述质控样品，并分别加入370μL所述内标工作液，涡旋离心后取上清液100μL，再加入300μL的甲醇溶液，涡旋混匀后取0.5μL在高效液相质谱联用仪(HPLC-MS/MS)上进样分析； (3)标准曲线的制作：以Rutin比内标Osalmide、Ombuoside比内标Osalmide的色谱峰面积比为纵坐标，以犬血浆中Rutin、Ombuoside的浓度为横坐标制作标准曲线； (4)定量分析：根据步骤(2)对待测样品进行处理，并按照步骤(3)所得所述标准曲线计算得到所述待测样品中的Rutin、Ombuoside的浓度。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中高效液相质谱联用仪的工作条件为： (1)色谱条件为： 色谱柱：ACE C18(2.1mm x 50mm,5AQ),ACE，柱温为40℃； 自动进样器温度：8℃； 流动相A：0.2％乙酸水溶液； 流动相B：0.2％甲醇溶于甲醇-乙腈溶液； 进样器清洗液：R0:MeOH/H2O(30/70，v/v)；R3:MeOH； 洗脱方式：梯度洗脱； (2)质谱条件为： 质谱仪：AB SCIEX API5000 LC/MS/MS system； 离子源：ESI电喷雾电离； 离子化模式：Positive； 检测模式：MRM多反应监测； 涡旋离子喷雾温度：550℃。 3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，利用等浓度的所述Rutin和所述Ombuoside混合再用甲醇-水溶液稀释成的所述校正标示样品工作液的梯度浓度分别为80000、32000、3200、800、400ng/mL；利用等浓度的所述Rutin和所述Ombuoside混合再用甲醇-水溶液稀释成的所述质控工作液的梯度浓度分别为2*105、1.2*104、1200、400ng/mL；所述校正标示样的梯度浓度分别为2*104、1.6*104、4*103、1.6*103、160、40、20ng/mL；所述质控样品的梯度浓度分别为1.5*104、1*104、600、60、20ng/mL。 4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述校正标示样和所述质控样品是当天使用所述空白基质连续稀释新鲜配置得到。 5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的离心条件为：10℃，4000rpm，离心10min。 6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中还包括对空白(BK)样品、QC0样品、ULOQ without IS样品的处理：取30μL空白基质形成所述空白样品；在30μL空白基质中加入370μL所述内标工作液形成所述QC0样品；所述空白(BK)样品、所述ULOQ withoutIS样品中加入370μL甲醇溶液；所述空白(BK)样品、所述QC0样品、所述ULOQ without IS样品在稀释混合后涡旋离心取上清液100μL，再加入300μL的甲醇溶液，涡旋混匀后取0.5μL进样分析。 7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中还包括对基质效应样品的处理：取单个供体(n≥6)的30μL的空白基质，并加入370μL甲醇溶液，涡旋离心后取上清液100μL，再加入50μL的Neat溶液和250μL的甲醇溶液，涡旋混匀后取0.5μL进样分析。 8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中还包括对回收率样品的处理：取单个供体的空白基质，再取30μL的多个供体的混合的所述空白基质形成所述回收率样品，并加入370μL甲醇溶液，涡旋离心后取上清液100μL，再加入50μL的Neat溶液和250μL的甲醇溶液，涡旋混匀后取0.5μL进样分析。 |
| 所属类别： | 发明专利 |
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