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原文传递血清中维生素D代谢物-25（OH）D3的提取方法及检测方法

专利名称：	血清中维生素D代谢物-25（OH）D3的提取方法及检测方法
摘要：	本发明公开了一种血清中维生素D代谢物‑25（OH）D3的提取方法及检测方法，该提取方法包括：1）使25（OH）D3从沉淀蛋白中释放出，再瞬离至少一次，从而获得含有25（OH）D3、磷脂和蛋白质的混合物样品；2）利用硅藻土萃取板至少吸附混合物样品中的磷脂和蛋白质；3）对硅藻土萃取板进行洗脱，然后压合硅藻土萃取板和收集板从而收集含有25（OH）D3的洗脱液；4）吹干收集板，并复溶维生素D；该检测方法包括将血清中维生素D代谢物‑25（OH）D3的提取方法所获的25（OH）D3的复溶液作为待检测物；将待检测物上样至液相色谱串联质谱仪检测。本发明提供的提取方法即萃取方法,可同时完成样品富集与净化，萃取率更高,能够大大提高后续检测的灵敏度。
专利类型：	发明专利
申请人：	苏州康吉诊断试剂有限公司
发明人：	傅强;谢利德;程亚美;丁浩
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T15:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T00:00:00+0805
申请号：	CN202010041949.1
公开号：	CN111198237A
代理机构：	苏州汉东知识产权代理有限公司
代理人：	葛娟
分类号：	G01N30/02;G01N30/06;G01N30/30;G01N30/34;G01N30/72;G;G01;G01N;G01N30;G01N30/02;G01N30/06;G01N30/30;G01N30/34;G01N30/72
申请人地址：	215000 江苏省苏州市太仓港经济技术开发区银港路52号
主权项：	1.一种血清中维生素D代谢物-25（OH）D3的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1）样品提取：取设定量的血清放置于离心管中，再向离心管中加入沉淀蛋白破坏剂以破坏血清中的沉淀蛋白从而使得25（OH）D3从沉淀蛋白中释放出，将血清样品与沉淀蛋白破坏剂混合均匀后再瞬离至少一次，从而获得含有25（OH）D3、磷脂和蛋白质的混合物样品；步骤2）上样：将步骤1）中所获得混合物样品上样到硅藻土萃取板，待全部的混合物样品浸入至硅藻土萃取板后静置，该硅藻土萃取板至少吸附混合物样品中的磷脂和蛋白质；步骤3）洗脱：对硅藻土萃取板进行至少一次的洗脱处理，洗脱结束后，将硅藻土萃取板与收集板整体上下叠合，然后压合硅藻土萃取板和收集板从而使得收集板收集含有25（OH）D3的洗脱液；步骤4）复溶：以气体吹收集板至洗脱液的溶剂蒸发而剩下存留在收集板的孔内的25（OH）D3的萃取物，向收集板的孔内加入复溶剂对萃取物进行复溶，从而获得25（OH）D3的复溶液。 2.根据权利要求1所述的血清中维生素D代谢物-25（OH）D3的提取方法，其特征在于：所述步骤1）中，取100-200μL血清样品加入至离心管中，再向离心管中加入100-300μL体积比为50:50的水/异丙醇混合液作为沉淀蛋白破坏剂破坏血清中的沉淀蛋白，在2500-3000rpm转速下涡旋混合均匀，并且以7000-12000rpm转速瞬离10-50s；优选的，在第一次瞬离结束后，至少再向离心管内再加入100-300μL50:50的水/异丙醇混合液，并且在2500-3000rpm转速下涡旋至少1min，而后均匀混合后在7000-12000rpm转速下瞬离10-50s。 3.根据权利要求2所述的血清中维生素D代谢物-25（OH）D3的提取方法，其特征在于：所述步骤2）中，将所述步骤1）中所获得混合物样品上样到400-500μL/mL的硅藻土萃取板中，待全部的混合物样品浸入至硅藻土萃取板后静置3-6min。 4.根据权利要求3所述的血清中维生素D代谢物-25（OH）D3的提取方法，其特征在于：所述步骤3）中，用异辛烷或正己烷对硅藻土萃取板进行洗脱处理，分三次进行洗脱，最后一次洗脱结束后，以正压装置压合上下叠合的硅藻土萃取板和收集板；优选的，正压装置的开启压力为10-15psi，压合时间为5-8s；优选的，采用1.2-2.1 mL异辛烷或正己烷对硅藻土萃取板进行洗脱处理。 5.根据权利要求4所述的血清中维生素D代谢物-25（OH）D3的提取方法，其特征在于：所述步骤4）中，采用氮气仪制造氮气吹干收集板；和/或，采用100-200μL体积比为70:30的甲醇/水混合液作为用以溶解25（OH）D3的复溶剂；优选的，将25（OH）D3的复溶液以2000-4000rpm转速涡旋至少3min，再于4-8℃的温度下以2500-3000rpm转速下离心至少1min。 6.根据权利要求1-5中任一项所述的血清中维生素D代谢物-25（OH）D3的提取方法，其特征在于：所述硅藻土萃取板采用多孔板，所述多孔板的每个孔内填装有硅藻土，所述收集板采用多孔的塑料板，所述收集板具有与所述硅藻土萃取板相同数量的孔；优选的，所述塑料板采用聚乙烯板。 7.根据权利要求1-5中任一项所述的血清中维生素D代谢物-25（OH）D3的提取方法，其特征在于：所述硅藻土PH约为7-7.5；和/或，所述硅藻土的制备方法包括以下步骤： 1）称量一定量的硅藻土矿，利用筛网过筛进行预除杂； 2）利用蒸馏水反复洗涤硅藻土至少一次，洗涤纯净之后干燥硅藻土从而获得干燥的纯化硅藻土； 3)将步骤2）中所获得的提纯硅藻土放入容器中，并向容器内加入酸以对提纯硅藻土进行酸处理，而后进行保温、抽滤、洗涤，从而使得硅藻土的PH值达中性为止，最后，再进行干燥处理从而获得干燥的改性硅藻土。 8.根据权利要求7所述的血清中维生素D代谢物-25（OH）D3的提取方法，其特征在于：步骤1）中采用80-150目筛网过筛硅藻土矿；和/或，步骤2）中，将硅藻土与蒸馏水按照体积比为1:15-20的比例进行混合并间歇搅拌20-30min，使得硅藻土在水中充分化解，随后进行静置沉淀，抽滤掉上层悬浮液而获得沉淀于下层的硅藻土，如此反复三次以上从而获得纯化硅藻土，然后，将纯化硅藻土放入真空干燥箱中，于120-150℃下干燥2h以上，制得干燥的纯化硅藻土；和/或，步骤3）中，向作为容器的锥形瓶中加入3倍体积于硅藻土的硫酸/盐酸/磷酸溶液，在90-100℃恒温水浴锅中，保温4-5h。 9.一种血清中维生素D代谢物的检测方法，其特征在于包括：采用权利要求7所述的一种血清中维生素D代谢物-25（OH）D3的提取方法所获得的25（OH）D3的复溶液作为待检测物；将所述待检测物上样至液相色谱串联质谱仪，采用液相色谱串联质谱法进行检测。
所属类别：	发明专利