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原文传递一种同时检测外泌体内蛋白和RNA、外泌体膜蛋白的方法

专利名称：	一种同时检测外泌体内蛋白和RNA、外泌体膜蛋白的方法
摘要：	一种同时检测外泌体内蛋白和RNA、外泌体膜蛋白的方法，属于外泌体检测技术领域。该方法包括捕获样品中的外泌体；检测相应的膜蛋白；制备纳米颗粒；纳米颗粒与外泌体融合；全内反射荧光显微镜拍照成像，数据分析处理。本发明分别从外泌体表征检测、细胞上清外泌体膜蛋白和mRNA表达对比实验、人血浆外泌体特异性检测、人血浆外泌体膜蛋白对比实验、多样本人血浆外泌体膜内蛋白、RNA及膜蛋白检测方面进行了验证，并与现有公认的检测外泌体技术进行了比对实验，显示出本发明技术对于同一样本同时检测的相同标志物检测结果与上述公认技术的一致性，且本发明该技术可同时检测外泌体内蛋白、RNA及外泌体膜蛋白，并判断样本差异。
专利类型：	发明专利
申请人：	杭州迪相实业有限公司
发明人：	曾恒山
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T00:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T03:00:00+0805
申请号：	CN201911377286.4
公开号：	CN110954703A
代理机构：	杭州浙科专利事务所(普通合伙)
代理人：	沈渊琪
分类号：	G01N33/68;G01N33/577;G01N33/569;G01N33/53;G;G01;G01N;G01N33;G01N33/68;G01N33/577;G01N33/569;G01N33/53
申请人地址：	310000 浙江省杭州市西湖区三墩镇紫宣路279号汇禾领府3号楼301室
主权项：	1.一种同时检测外泌体内蛋白和RNA、外泌体膜蛋白的方法，所述RNA包括mRNA、miRNA、lncRNA和CircRNA，其特征在于包括以下步骤： 1)取沉淀法得到的粗制细胞外囊泡，在15～90V直流电场下，采用外泌体原位捕获芯片，直接捕获样品中的外泌体； 2)在步骤1)中捕获的外泌体膜上结合目标抗体，通过抗原和抗体结合，发出标记的A种荧光信号，检测相应的膜蛋白； 3)制备纳米颗粒，通过纳米颗粒包裹需检测靶标的RNA分子信标和荧光单抗； 4)将步骤3)中得到的已包裹RNA分子信标和荧光单抗的纳米颗粒与步骤2)的外泌体融合，RNA分子信标和荧光单抗进入外泌体内，RNA分子信标与相应的标靶基因结合，信标茎环结构打开，在激光激发下发出标记的B种荧光信号，检测相应的RNA；抗原和抗体结合，在激光激发下发出标记的C种荧光信号，检测相应的蛋白； 5)全内反射荧光显微镜拍照成像，数据分析处理。 2.如权利要求1所述的一种同时检测外泌体内蛋白和RNA、外泌体膜蛋白的方法，其特征在于所述步骤1)中的外泌体原位捕获芯片为：包被亲和素、生物素标记的外泌体特异性捕获抗体的原位捕获芯片。 3.如权利要求2所述的一种同时检测外泌体内蛋白和RNA、外泌体膜蛋白的方法，其特征在于所述的亲和素、生物素标记的特异性捕获抗体为公认的外泌体膜上标志抗体CD63和CD9。 4.如权利要求1所述的一种同时检测外泌体内蛋白和RNA、外泌体膜蛋白的方法，其特征在于所述步骤2)中所述目标抗体为能结合外泌体膜上抗原的特异性抗体。 5.如权利要求1所述的一种同时检测外泌体内蛋白和RNA、外泌体膜蛋白的方法，其特征在于所述步骤3)中所述纳米颗粒通过以下步骤制得： 1)将DOTMA、DSPE-PEG-2000和胆固醇按3:1:4充分混匀后，超声5min，室温静置2小时，即可获得稳定的阳离子脂质体； 2)将适量分子信标和荧光单抗及上述阳离子脂质体在PBS中充分吹打混匀后，超声5min； 3)取步骤1)的混合溶液，快速注入至含适量PBS的EP管中，涡旋10s，超声5min，室温静置2小时，即可获得稳定的纳米颗粒。 6.如权利要求1或5所述的一种同时检测外泌体内蛋白和RNA、外泌体膜蛋白的方法，其特征在于所述步骤3)中纳米颗粒中分子信标和荧光单抗的摩尔比1:2～1:5。 7.如权利要求1或5所述的一种同时检测外泌体内蛋白和RNA、外泌体膜蛋白的方法，其特征在于所述步骤3)中RNA分子信标为5’端茎和环与靶基因完全互补，3’端茎与5’端茎部分互补，5’端和3’端分别用荧光基团和淬灭基团修饰，环上部分碱基用锁核酸修饰。 8.如权利要求1或5所述的一种同时检测外泌体内蛋白和RNA、外泌体膜蛋白的方法，其特征在于所述步骤3)中的荧光单抗为针对特定外泌体内靶蛋白的荧光素标记的单克隆抗体。 9.权利要求1所述的一种同时检测外泌体内蛋白和RNA、外泌体膜蛋白的方法，其特征在于所述步骤4)中融合条件为异种电荷相吸和膜融合原理，在15～90V直流电场下，4～60℃条件下。
所属类别：	发明专利