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原文传递一种检测羊包虫病ELISA抗体检测试剂盒及其应用

专利名称：	一种检测羊包虫病ELISA抗体检测试剂盒及其应用
摘要：	本发明公开了一种羊包虫病ELISA抗体检测试剂盒及其制备方法与应用。该检测试剂盒中，酶标板预包被了细粒棘球蚴鸡尾酒抗原；所述细粒棘球蚴鸡尾酒抗原是由细粒棘球蚴鸡尾酒抗原是由EPC1重组抗原、EgAgB1重组抗原、EgAgB2重组抗原和EgAgB4重组抗原组成。使用本发明所提供的检测试剂盒可以快速检测羊血清中的包虫抗体，操作简单，耗时短，敏感性高，特异性好，便于同时检测大量样本。本发明所提供的羊包虫病ELISA抗体检测试剂盒在包虫病抗体水平检测、流行病学调查中具有重要的应用价值。
专利类型：	发明专利
申请人：	北京维德维康生物技术有限公司
发明人：	刘河冰;温凯;杨柳;李蓉蓉;马立才
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T00:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T03:00:00+0805
申请号：	CN201911388210.1
公开号：	CN110954690A
分类号：	G01N33/535;G;G01;G01N;G01N33;G01N33/535
申请人地址：	100095 北京市海淀区地锦路9号院3号楼
主权项：	1.羊包虫病ELISA抗体检测试剂盒，包括细粒棘球蚴鸡尾酒抗原预包被酶标板、阳性对照液、阴性对照液、酶标记物浓缩液、酶标记物稀释液、样本稀释液、底物A液、底物B液、终止液、洗涤液、血清稀释板；所述细粒棘球蚴鸡尾酒抗原是由EPC1重组抗原、EgAgB1重组抗原、EgAgB2重组抗原和EgAgB4重组抗原组成。 2.权利要求1所诉羊包虫病ELISA抗体检测试剂盒，酶标板材质为96孔固相酶标板NUNC-468667。 3.权利要求1所述的羊包虫病ELISA抗体检测试剂盒，细粒棘球蚴鸡尾酒抗原中表达的EPC1重组抗原、EgAgB1重组抗原、EgAgB2重组抗原和EgAgB4重组抗原的浓度比为2:1:2:1。 4.权利要求1所诉羊包虫病ELISA抗体检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤： 1）细粒棘球蚴鸡尾酒抗原的制备：以细粒棘球蚴cDNA文库为模版，针对EPC1、EgAgB1、EgAgB2和EgAgB4基因序列设计特异性引物，通过PCR扩增目的片段并克隆至表达载体pET28a，将成功构建的重组表达质粒pET28a-EPC-1、pET28a-EgAgB1、pET28a-EgAgB2和pET28a-EgAgB4转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，IPTG诱导表达，经亲和层析和分子筛层析高度纯化后得到EPC1重组蛋白、EgAgB1重组蛋白、EgAgB2重组蛋白和EgAgB4重组蛋白； 2）细粒棘球蚴鸡尾酒抗原预包被酶标板的制备：将鸡尾酒抗原用碳酸盐缓冲液稀释成浓度为5μg/mL的抗原包被液，每孔100μL，2-8℃包被16h后洗板；然后每孔加入200μL封闭液，37℃、湿度30-40%封闭2h，37℃、湿度30-40%恒温干燥2h；所述细粒棘球蚴鸡尾酒抗原中由EPC1重组抗原、EgAgB1重组抗原、EgAgB2重组抗原和EgAgB4重组抗原，终浓度分别为2.8mg/mL、1.4mg/mL、2.8mg/mL和1.4mg/mL； 3）阳性对照液的制备：试验用羊攻虫270日血清1:100倍稀释； 4）阴性对照液的制备：健康绵羊血清1:100倍稀释； 5）酶标记物浓缩液的制备：辣根过氧化物标记的Mouse Anti-goat IgG-HRP 1:30000倍稀释； 6）酶标记物稀释液的制备：0.01M pH7.4的PBST溶液； 7）样品稀释液的制备：0.01M pH7.4的PBS溶液； 8）底物A液的制备：含0.08%过氧化脲、0.025%PEG-2000、3.58%十二水合磷酸氢二钠、0.96%一水合柠檬酸水溶液，调pH值至7.4； 9）底物B液的制备：含1.03%一水合柠檬酸、0.04% TMB、0.0008%硫代硫酸钠、0.1%光稳定剂292、3% DMF水溶液，调pH值至5.0； 10）终止液的制备：含0.1% 10%SDS、5.56%硫酸水溶液； 11）洗涤液的制备：0.25M pH7.4的PBST溶液。 5.权利要求4所述EPC1重组抗原制备时所用的引物如序列表的序列1-2所示，EPC1重组抗原核酸序列可如序列表的序列3所示；EgAgB1重组抗原制备时所用的引物如序列表的序列4-5所示，EgAgB1重组抗原核酸序列可如序列表的序列6所示；EgAgB2重组抗原制备时所用的引物如序列表的序列7-8所示，EgAgB2重组抗原核酸序列可如序列表的序列9所示；EgAgB4重组抗原制备时所用的引物如序列表的序列10-11所示，EgAgB4重组抗原核酸序列可如序列表的序列12所示。 6.权利要求1所诉羊包虫病ELISA抗体检测试剂盒在包虫病检测中的应用。
所属类别：	发明专利