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原文传递恶性卡他热病毒的检测试剂盒、制备方法及其用途

专利名称：	恶性卡他热病毒的检测试剂盒、制备方法及其用途
摘要：	本发明提供恶性卡他热病毒的检测试剂盒、制备方法及其用途，属于生物技术领域，包括包被有MCFV gB重组蛋白的酶标板，所述MCFV gB蛋白为SEQ ID NO.1的序列，酶标抗体，包括HRP标记的MCFV gB重组蛋白多克隆抗体。本发明提高的制备方法能够提高重组蛋白的反应原性和免疫原性，提高纯化后的重组蛋白的纯度；提供的检测试剂盒具有较好的特异性，且操作简单，具有较高的检出率。
专利类型：	发明专利
申请人：	霸州市砚创科技有限公司
发明人：	沈志功
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T00:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T07:00:00+0805
申请号：	CN201911381775.7
公开号：	CN110967483A
代理机构：	北京睿博行远知识产权代理有限公司
代理人：	龚家骅
分类号：	G01N33/569;G01N33/558;G01N33/535;G;G01;G01N;G01N33;G01N33/569;G01N33/558;G01N33/535
申请人地址：	065000 河北省廊坊市霸州市霸州镇王伍房村
主权项：	1.一种恶性卡他热病毒的检测试剂盒，其特征在于，包括： ——包被有MCFV gB重组蛋白的酶标板，所述MCFV gB蛋白为SEQ ID NO.1的序列； ——酶标抗体，包括HRP标记的MCFV gB重组蛋白多克隆抗体；所述检测试剂盒的结果判断标准为：样品血清抑制率≧28.3％时，为阳性；样品血清抑制率﹤28.3％时，为阴性。 2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述MCFV gB重组蛋白的制备方法包括：以MCFV基因组为模板，对MCFV gB蛋白基因进行扩增，将得到的PCR产物与表达质粒pET-28a连接后导入大肠杆菌BL21中进行诱导表达，然后经分离纯化获得。 3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：所述MCFV gB蛋白基因扩增所用引物为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4。 4.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：所述MCFV gB重组蛋白的诱导表达方法为：将含有阳性质粒的菌液接种于含Amp的液体LB中培养至菌液OD600的值为0.45-0.55，加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG、终浓度为0.17-0.34mmol/L的1,2,4-三氮唑钠、终浓度为1.0-1.45mmol/L的4-羟基-3-甲氧基苄醇，诱导培养4-6h。 5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于：所述表达蛋白以可溶性蛋白的形式存在。 6.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：所述MCFV gB重组蛋白的纯化方法为： a、将诱导好的菌液离心收集沉淀，用缓冲液(50mmol/L Tris-HCl,pH值8.0)悬浮菌体，超声破碎，离心取上清，经0.45μm滤膜过滤后，加入终浓度为0.6-0.83mg/mL的三甲基溴化亚砜和终浓度为0.26-0.34mg/mL的2-磺胺吡啶。 b、用平衡缓冲液对Ni-NTA His·Bind镍离子树脂洗涤，再用平衡缓冲液重悬后装入层析柱，自然沉降，将步骤a中的上清过柱； c、用洗涤缓冲液洗去杂蛋白； d、用洗脱缓冲液洗下目标蛋白。 7.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述MCFV gB重组蛋白多克隆抗体的制备方法：取浓度1.13-1.25mg/mL的纯化的MCFV gB重组蛋白对家兔进行免疫，免疫程序为0d、3-5d、25-28d、32-35d，首次免疫和二次免疫采用重组蛋白与等体积弗氏完全佐剂完全乳化，三次免疫和四次免疫采用重组蛋白与等体积弗氏不完全佐剂完全乳化，乳化后的使用剂量均为250-280μg/只，免疫完成后进行心脏采血并分离血清，纯化。 8.1,2,4-三氮唑钠和4-羟基-3-甲氧基苄醇在促进可溶性重组蛋白表达中的用途。 9.权利要求1-7任一项中所述的检测试剂盒在检测绵羊MCFV抗体中的用途。 10.权利要求1-7任一项中所述的检测试剂盒在检测牛MCFV抗体中的用途。
所属类别：	发明专利