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原文传递化学发光酶联核酸适体同步检测VEGF与CEA的方法

专利名称：	化学发光酶联核酸适体同步检测VEGF与CEA的方法
摘要：	本发明提供一种化学发光酶联核酸适体同步检测VEGF与CEA的方法，该方法制备了两种磁性酶标检测探针cDNA1‑MBs@Apt1‑HRP和cDNA2‑MBs@Apt2‑ALP，一方面探针上的两种核酸适体Apt1和Apt2可以实现对两种目标物的特异性识别，另一方面HRP和ALP两种标记物可以催化不同的化学发光底物，触发两种模式的化学发光。最终以时间分辨的方式分别在1.0 s和20 min两个时间窗口检测各目标物的化学发光信号，从而实现对VEGF和CEA的同步检测。用建立的方程对实际样品进行检测，其结果与试剂盒检测结果无统计学差异，表明该方法准确度较高。
专利类型：	发明专利
申请人：	郑州大学
发明人：	吴拥军;王艺琳;屈凌波;董佳佳;韩润平;于斐;何磊良;刘利娥;玉崧成;王佳;田咏梅
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T19:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T17:00:00+0805
申请号：	CN201911317493.0
公开号：	CN111024945A
代理机构：	郑州德勤知识产权代理有限公司
代理人：	王莉
分类号：	G01N33/574;G01N21/76;G;G01;G01N;G01N33;G01N21;G01N33/574;G01N21/76
申请人地址：	450001 河南省郑州市高新技术产业开发区科学大道100号
主权项：	1.一种化学发光酶联核酸适体同步检测VEGF与CEA的方法，具体步骤包括：提供一种VEGF检测探针和一种CEA检测探针；提供一种化学发光底液1和一种化学发光触发液；将所述VEGF检测探针和所述CEA检测探针混合后置于化学发光板中，磁分离去上清；然后再向所述化学发光板中加入不同浓度的VEGF与CEA的混合标准溶液，并进行温育、磁分离、BST洗3至5次；最后向所述化学发光板中加入所述化学发光底液1和所述化学发光触发液，分别在1.0s和20min时间窗口记录RLU数值；分别根据VEGF的RLU信号值与对应的VEGF浓度CVEGF的关系、根据CEA的RLU信号值与对应的CEA浓度CCEA的关系，分段建立检测VEGF的回归方程和建立检测CEA的回归方程；其中，当所述VEGF的浓度在0.5ng/mL～80ng/mL范围内，建立的标准方程为Y＝0.2603X+4.3684，此公式中Y代表lg(RLU0-RLU)，X代表lgCVEGF，r取0.9882，所述VEGF的浓度检出限为0.1ng/mL；当所述CEA的浓度在0.5ng/mL～160ng/mL范围内，建立的标准方程为Y＝5032.03X+27732.14；此公式中Y代表RLU0-RLU，X代表lgCCEA，r取0.9893；所述CEA的浓度检出限为0.1ng/mL。 2.根据权利要求1所述的化学发光酶联核酸适体同步检测VEGF与CEA的方法，其特征在于，提供所述VEGF检测探针的步骤包括：配制400nmol/L的cDNA1溶液，并在95℃下加热3min，之后放入4℃冰箱中冷却至室温，得到处理后cDNA1溶液；取300μL磁珠于离心管中，并加入500mL TBST清洗两遍，磁分离去上清，然后再向所述离心管中加入300μL浓度为400nmol/L的所述处理后cDNA1溶液，室温下涡旋反应30min后，用TBST对磁珠清洗两遍，磁分离去上清；最后再将浓度为60nmol/L的Apt1-HRP加入所述离心管中，室温涡旋反应50min，磁分离去上清，用TBST清洗两遍，并保存于600μL温度为4℃的TBS缓冲液中，得到所述VEGF检测探针，记作cDNA1-MBs@Apt1-HRP。 3.根据权利要求2所述的化学发光酶联核酸适体同步检测VEGF与CEA的方法，其特征在于，提供所述CEA检测探针的步骤包括：将400nmol/L cDNA2溶液置于95℃下加热3min，然后放入4℃冰箱中冷却至室温，得到处理后cDNA2溶液；取300μL磁珠于离心管中，用TBST清洗两遍，磁分离去上清，向所述离心管中加入300μL浓度为400nmol/L的所述处理后的cDNA2溶液，在室温下涡旋30min，之后用TBST清洗两遍，磁分离去上清；取100nmol/L的Apt2与ALP-SA室温下涡旋反应20min，使其形成Apt2-ALP复合物；最后将所述Apt2-ALP复合物加入所述离心管中，室温涡旋反应50min，磁分离去上清，用TBST清洗两遍，并保持在600μL温度为4℃的TBS缓冲液中，得到所述CEA检测探针，记作cDNA2-MBs@Apt2-ALP。 4.根据权利要求3所述的化学发光酶联核酸适体同步检测VEGF与CEA的方法，其特征在于，所述化学发光底液1是通过以下步骤制备的：将1.4mL鲁米诺储存液和28.6μL增强剂储存液进行混合，然后用0.1mol/L、pH＝8.5的Tris-HCl缓冲液定容至10mL，得到所述化学发光底液1。 5.根据权利要求4所述的化学发光酶联核酸适体同步检测VEGF与CEA的方法，其特征在于，所述化学发光触发液是通过以下步骤制备的：用Milli-Q水将25.5μL 30％H2O2溶液稀释、定容至25mL，得到化学发光底液2；取200μLAMPPD储备液，用0.1mol/L、pH＝8.5的Tris-HCl将稀释为1mg/mL，得到化学发光底液3；将所述化学发光底液2与所述化学发光底液3以1:1的体积比混合，得到所述化学发光触发液；所述VEGF为VEGF165。 6.根据权利要求5所述的化学发光酶联核酸适体同步检测VEGF与CEA的方法，其特征在于，它还包括利用所述VEGF检测探针、所述CEA检测探针所述、化学发光底液1和所述化学发光触发液检测血清样品分别在1.0s和20min时间窗口的RLU数值，然后将记录的不同时间窗口的RLU数值分别代入建立的检测VEGF的回归方程和建立检测CEA的回归方程中，分别计算出血清样品中的VEGF浓度和CEA浓度的步骤。
所属类别：	发明专利