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原文传递基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析方法

专利名称：	基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析方法
摘要：	本发明涉及一种基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析试剂盒、检测方法及其制备方法，通过制备2株针对HIV患者体液中抗体的特异性重组抗原，其中一株重组抗原用于偶联磁珠(免疫磁珠①)，另一株重组抗原用铕离子标记；同时制备另外2株针对HCV患者体液中抗体的特异性重组抗原，其中一株重组抗原用于偶联磁珠(免疫磁珠②)，另一株重组抗原用钐离子标记。先通过双抗原夹心的免疫反应，形成免疫磁珠①‑HIV抗体‑铕标记抗原复合物，及免疫磁珠②‑HCV抗体‑钐标记抗原复合物，再通过磁性分离技术将吸附人HIV及HCV抗体的免疫磁珠与上清分离洗涤，最后加入增强液并通过时间分辨仪器测值。本发明检测灵敏度高、时间短、误差小且可靠性高。
专利类型：	发明专利
申请人：	南方医科大学
发明人：	吴英松
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T00:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T08:00:00+0805
申请号：	CN201911376485.3
公开号：	CN111122859A
代理机构：	北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	赵蕊红
分类号：	G01N33/569;G01N33/543;G;G01;G01N;G01N33;G01N33/569;G01N33/543
申请人地址：	510515 广东省广州市广州大道北1838号南方医科大学生物技术学院抗体工程研究所
主权项：	1.一种基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征在于：含有偶联有HIV重组抗原的免疫磁珠、偶联有HCV重组抗原的免疫磁珠、铕离子标记HIV-Ag及钐离子标记HCV-Ag，偶联有HIV重组抗原的免疫磁珠称为免疫磁珠①，偶联有HCV重组抗原的免疫磁珠称为免疫磁珠②。 2.根据权利要求1所述的基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征在于：还含有两株生物素化的HIV抗原和两株生物素化的HCV抗原；其中一株HIV抗原用于偶联免疫磁珠①，另外一株HIV抗原用铕离子标记；一株HCV抗原用于偶联免疫磁珠②，另外一株HCV抗原用钐离子标记。 3.根据权利要求2所述的基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征在于：检测方法是先通过双抗原夹心的免疫反应，形成免疫磁珠①-HIV-Ab-铕标记抗原复合物、免疫磁珠②-HCV-Ab-钐标记抗原复合物，再通过磁性分离技术将吸附HIV-Ab及HCV-Ab的免疫磁珠与上清分离洗涤，最后加入增强液并通过时间分辨仪器测值。 4.一种基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析方法，其特征在于：具有如下步骤， (1)链霉亲和素磁珠制备：具体经过磁珠活化、链霉亲和素与磁珠偶联、洗涤、封闭、保存步骤制备得到链霉亲和素磁珠； (2)生物素化抗原制备：具体经过生物素与抗原连接、透析、保存步骤制备得到高特异性的生物素化的HIV和HCV抗原； (3)铕和钐离子标记抗原制备：具体是分别选用一株HIV-Ag进行Eu3+标记，一株HCV-Ag进行Sm3+标记，制备得铕离子标记HIV-Ag及钐离子标记HCV-Ag；其中，以体积比计，HIV-Ag与Eu3+标记物的比例为5:1，HCV-Ag与Sm3+标记物的比例为2.5:1； (4)测定方法：往反应管加入100μl样品，再加入用分析缓冲液以体积比为1:30稀释的步骤(1)制备的链霉亲和素磁珠50μl，然后加入用分析缓冲液以体积比为1:100稀释的步骤(2)制备的生物素化抗原各50μl，室温震荡孵育45分钟；运用磁性分离技术将吸附HIV-Ab及HCV-Ab的免疫磁珠与上清分离洗涤；最后加入用分析缓冲液以体积比为1:25稀释的步骤(3)制备得铕离子标记HIV-Ag及钐离子标记HCV-Ag各100μl，室温震荡孵育45分钟；重复分离洗涤步骤，最后加入200μl增强液震荡孵育5min进行荧光检测。 5.根据权利要求4所述的基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析方法，其特征在于：在步骤(1)中，磁珠活化过程为：取1ml重悬后的磁珠,重复洗涤3次，加入25μl 10mg/ml的EDC和40μl10mg/ml的NHS，用样本旋转混合仪，室温旋转30min；洗涤过程中使用的洗涤液的为：将25mM的Tris-HCl、0.15M NaCl加入1ml体积百分比为0.05％的Tween 20，用浓盐酸调节PH值得到pH 7.2的缓冲液；封闭过程中使用的封闭液为：以重量份计，含有15％的蔗糖、10％的小牛血清、75％的去离子水，用浓盐酸调节PH值得到的pH 7.0的缓冲液；磁珠保存过程中使用的保存液为：25mM的Tris-HCl、0.15M的NaCl加入1ml体积百分比为0.05％的Tween 20，用浓盐酸调节PH值得到的得到的pH 7.2的缓冲液。 6.根据权利要求4所述的基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析方法，其特征在于：在步骤(2)中， Eu3+和Sm3+标记抗原稀释所用分析缓冲液的成分为：50mM的Tris-HCl、质量浓度1.5％的PEG 6000、质量浓度0.2％的BSA、体积浓度0.1％的Proclin 300、质量浓度0.02％的牛IgG、体积浓度0.1％的Tween 20、质量浓度0.84％的NaCl，分析缓冲液的pH值为7.8。 7.根据权利要求4所述的基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析方法，其特征在于：在步骤(4)中，洗涤采用25×洗涤液进行，25×洗涤液的成分为：1.25mM Tris-HCl、体积浓度2.5％Tween 20、质量浓度21％NaCl，洗涤液的pH为7.8。 8.根据权利要求4所述的基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析方法，其特征在于：在步骤(3)中，增强液的成分为：质量浓度0.1％β2二酮体、质量浓度1％三辛基氧化磷、体积浓度0.1％Triton 200、体积浓度1.5％醋酸和质量浓度0.1％邻苯二甲酸氢钾，增强液的pH值为2.0～3.2。 9.如权利要求1至3中任意一项所述的基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析试剂盒的制备方法，其特征在于：依次包括， (1)链霉亲和素磁珠制备：具体经过磁珠活化、链霉亲和素与磁珠偶联、洗涤、封闭、保存步骤制备得到链霉亲和素磁珠； (2)生物素化抗原制备：具体经过生物素与抗原连接、透析、保存步骤制备得到高特异性的生物素化的HIV和HCV抗原； (3)铕和钐离子标记抗原制备：具体是分别选用一株HIV-Ag进行Eu3+标记，一株HCV-Ag进行Sm3+标记，制备得铕离子标记HIV-Ag及钐离子标记HCV-Ag；其中，以体积比计，HIV-Ag与Eu3+标记物的比例为5:1，HCV-Ag与Sm3+标记物的比例为2.5:1； (4)洗液、分析缓冲液和增强液的配置。 10.根据权利要求8所述的基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析试剂盒的制备方法，其特征在于：分析缓冲液的配方为：配制完成后，混匀，使用浓盐酸调pH值至7.8，然后分装到棕色聚乙烯塑料瓶中；洗液为25x洗液，配方为：配制完成后，混匀，使用浓盐酸调pH值至7.8，然后分装到棕色聚乙烯塑料瓶中；增强液配方为：配制完成后，混匀，放置30分钟后观察无晶体或沉淀析出，应采用电子pH计进行检测pH应控制在2.0-3.2之间，然后分装到棕色聚乙烯塑料瓶中。
所属类别：	发明专利