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原文传递一种单检测线的多指标时间分辨荧光免疫分析检测方法

专利名称：	一种单检测线的多指标时间分辨荧光免疫分析检测方法
摘要：	本发明公开了一种单检测线的多指标时间分辨荧光免疫分析检测方法。该方法应用单检测线的多指标时间分辨荧光免疫分析检测系统，包括单检测线的多指标时间分辨荧光免疫分析检测试纸条和多色镧系元素编码的功能性时间分辨荧光免疫分析纳米微球探针。该检测试纸条包括样品垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和粘性底衬，所述硝酸纤维素膜上依次涂有检测线T和质控线C。检测线T由三种不同的单克隆IgG涂层组成，质控线C由羊抗兔IgG组成。本发明应用双抗体夹心免疫法和多色镧系元素的荧光特性，实现在单检测线的时间分辨荧光免疫分析检测试纸条上同时定量检测三种不同目标抗原浓度。本发明具有高特异性、高灵敏度、高准确度、高稳定性的优点。
专利类型：	发明专利
申请人：	南方医科大学
发明人：	吴英松;陈振华;刘天才
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T00:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T01:00:00+0805
申请号：	CN201911388078.4
公开号：	CN111089968A
代理机构：	北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	赵蕊红
分类号：	G01N33/58;G01N33/577;G01N33/558;G;G01;G01N;G01N33;G01N33/58;G01N33/577;G01N33/558
申请人地址：	510515 广东省广州市白云区沙太南路1023号-1063号
主权项：	1.一种单检测线的多指标时间分辨荧光免疫分析检测系统，其特征在于，包括单检测线的多指标时间分辨荧光免疫分析检测试纸条和多色镧系元素编码的功能性时间分辨荧光免疫分析纳米微球探针；所述检测试纸条由粘性底衬、样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组成；所述硝酸纤维素膜上依次涂有检测线T和质控线C；所述检测线T由抗BTA单克隆IgG、抗NMP-22单克隆IgG和抗CYFRA 21-1单克隆IgG的混合物涂层组成；质控线C由羊抗兔IgG涂层组成；所述多色镧系元素编码的功能性时间分辨荧光免疫分析纳米微球探针包括检测探针和质控探针，所述多色镧系元素包括铽元素、铕元素和钐元素；所述检测探针包括抗BTA探针、抗NMP-22探针和抗CYFRA 21-1探针，所述抗BTA探针由抗BTA单克隆IgG和铽元素编码的聚苯乙烯纳米微球组成，所述抗NMP-22探针由抗NMP-22单克隆IgG和铕元素编码的聚苯乙烯纳米微球组成，所述抗CYFRA 21-1探针由抗CYFRA 21-1单克隆IgG和钐元素编码的聚苯乙烯纳米微球组成；所述质控探针由兔IgG和等量的铽元素、铕元素和钐元素编码的聚苯乙烯纳米微球组成；所述检测探针与所述检测线T的单克隆IgG捕获目标抗原形成双抗体夹心免疫复合物，并固定在所述检测线T；所述质控探针的兔IgG与所述质控线C的羊抗兔IgG形成免疫复合物，并固定在所述质控线C；利用荧光读数仪读取检测线T和质控线C处的铽元素、铕元素和钐元素对应的荧光信号，计算不同浓度抗原工作液的同种元素荧光信号的T/C值，并以所述同种镧系元素的T/C值为Y轴，对应目标抗原浓度为X轴，拟合目标抗原浓度的标准工作曲线，用于检测分析待测样品中的目标抗原浓度。 2.根据权利要求1所述的单检测线的多指标时间分辨荧光免疫分析检测系统，其特征在于，所述检测试纸条的制备方法按以下步骤进行：将未经裁切的样品垫、硝酸纤维素膜、吸水纸依次搭接于粘性底衬上，所述硝酸纤维素膜的两个搭接端分别位于样品垫搭接端和吸水纸搭接端的下方；按所述样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸的分布方向裁切，获得检测试纸条；所述样品垫是预先制备的，样品垫的制备具体为：将样品垫浸泡在含有1wt％聚乙烯吡咯烷酮，0.2wt％干酪素钠，1wt％Triton X-100和0.1wt％叠氮钠的0.1mol/L硼酸盐缓冲液中，静置1h后取出，放置于35～38℃的鼓风干燥箱内烘干过夜，干燥封存备用；所述硝酸纤维素膜是预先制备的，硝酸纤维素膜的制备具体为：将抗BTA单克隆IgG、抗NMP-22单克隆IgG和抗CYFRA 21-1单克隆IgG分别用10mM磷酸盐缓冲液稀释至1.5～2mg/mL，等体积混合三种单克隆捕获IgG溶液并装入划膜仪，以0.8～1.0μL/cm的溶液划线浓度，将单克隆捕获IgG混合溶液均匀地喷涂在硝酸纤维素膜上形成检测线T；将羊抗兔IgG用10mM磷酸盐缓冲液稀释至1.5～2mg/mL后，装入划膜仪，以0.6～0.8μL/cm的溶液划线浓度，将羊抗兔IgG均匀地喷涂在硝酸纤维素膜上形成质控线C；喷涂完毕后将硝酸纤维素膜放置于36～38℃的鼓风干燥箱内烘干过夜，干燥封存备用。 3.根据权利要求2所述的单检测线的多指标时间分辨荧光免疫分析检测系统，其特征在于，所述检测线T接近样品垫，所述质控线C接近吸水纸；所述检测线T和质控线C平行设置，两者相距3～4mm；所述检测线T和质控线C均为实直线。 4.根据权利要求2所述的单检测线的多指标时间分辨荧光免疫分析检测系统，其特征在于，所述检测试纸条总长度为5.5～6.0cm，宽度为3～4mm；所述样品垫与硝酸纤维素膜搭接端的长度为4mm，所述吸水纸与硝酸纤维素膜搭接端的长度为2mm；所述样品垫和吸水纸分别与粘性底衬相接触部分的长度为1～1.5cm。 5.根据权利要求2所述的单检测线的多指标时间分辨荧光免疫分析检测系统，其特征在于，所述10mM磷酸盐缓冲液的pH值为7.3～7.4，含0.9wt％氯化钠、0.3wt％海藻糖和0.1wt％叠氮钠。 6.根据权利要求1所述的单检测线的多指标时间分辨荧光免疫分析检测系统，其特征在于，所述多色镧系元素编码的功能性时间分辨荧光免疫分析纳米微球探针的制备方法，按以下步骤进行： S101，制备多色镧系元素编码的聚苯乙烯纳米微球；将20mmol苯乙烯单体，0.2～0.3mmol铽元素螯合物和0.15mmol偶氮二异丁腈混合均匀，获得反应液A；将0.15～0.2mmol十六烷基三甲基溴化铵与1.0～1.5mmol丙烯酸，加入15mL去离子水溶解，获得反应液B；在三口烧瓶中混合反应液A和反应液B，获得混合液；往混合液中通入纯度大于90％的氮气2h，排尽空气；将混合液超声乳化30min后，继续通入纯度大于90％的氮气10～15min，密封三口烧瓶；将混合液加热至70℃，在避光条件下，搅拌反应18～20h后降至室温备用；用截留分子量7000～14000Da的透析袋及去离子水透析上述混合液3～5天，获得透析液；以上述透析液的40000～50000×质量的去离子水离心洗涤上述透析液30min，重复洗涤3～5次，收集离心沉淀，以10wt％浓度的乙醇溶液重悬上述沉淀后，获得铽元素编码的聚苯乙烯纳米微球，于4℃避光保存备用；同理制备铕元素编码的聚苯乙烯纳米微球和钐元素编码的聚苯乙烯纳米微球； S102，制备功能性时间分辨荧光免疫分析纳米微球检测探针和质控探针；所述检测探针按以下步骤制备：取50～100μg的抗BTA单克隆IgG，用50mM磷酸盐缓冲液补充至体积为500μL后，加入到超滤管中，离心超滤3～5次，获得纯化后的抗BTA单克隆IgG，于4℃保存备用；同理制备抗NMP-22单克隆IgG和抗CYFRA 21-1单克隆IgG备用；取铽元素编码的聚苯乙烯纳米微球1mg，加入到50mM MES缓冲液离心洗涤3～5次，沉淀用0.4mL MES缓冲液重悬，然后加入10μL 10mg/mL的碳二亚胺溶液和90μL 10mg/mL的N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液，混合液在室温下缓慢震荡孵育30min后，用50mM磷酸盐缓冲液离心洗涤3～5次；所得沉淀用50mM磷酸盐缓冲液重悬分散，得到纯化后的铽元素编码的聚苯乙烯纳米微球悬浮液，备用；同理制备纯化后的铕元素编码的聚苯乙烯纳米微球悬浮液和钐元素编码的聚苯乙烯纳米微球悬浮液备用；将所述抗BTA单克隆IgG与铽元素编码的聚苯乙烯纳米微球悬浮液混合均匀，室温震荡孵育18～24h后，加入10μL乙醇胺，进一步室温震荡孵育30min；离心洗涤除去未反应的化合物，离心沉淀为抗BTA探针，重悬于探针储存液中，于4℃避光保存备用；同理制备抗NMP-22探针和抗CYFRA 21-1探针；所述质控探针按以下步骤制备：取100～150μg的兔IgG用50mM磷酸盐缓冲液补充至体积为500μL后，加入到超滤管中，离心超滤3～5次，得到纯化后的兔IgG，于4℃保存备用；分别取铽元素、铕元素和钐元素编码的聚苯乙烯纳米微球各0.5mg，加入到50mM MES缓冲液离心洗涤3～5次，沉淀用0.4mL MES缓冲液重悬，然后加入10μL 15mg/mL的碳二亚胺溶液和90μL 15mg/mL的N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液，混合液在室温下缓慢震荡孵育30min后，用50mM磷酸盐缓冲液离心洗涤3～5次；所得沉淀用50mM磷酸盐缓冲液重悬分散，得到纯化后的铽元素、铕元素和钐元素编码的聚苯乙烯纳米微球混合悬浮液，备用；将所述兔IgG与铽元素、铕元素和钐元素编码的聚苯乙烯纳米微球混合悬浮液混合均匀，室温震荡孵育18～24h后，加入10μL乙醇胺，进一步室温震荡孵育30min；离心洗涤除去未反应的化合物，离心沉淀为功能性时间分辨荧光免疫分析纳米质控探针，重悬于探针储存液中，于4℃避光保存备用。 7.根据权利要求6所述的单检测线的多指标时间分辨荧光免疫分析检测系统，其特征在于，所述聚苯乙烯纳米微球由苯乙烯和丙烯酸共聚合所得，并且在聚合的过程中将多色镧系元素螯合物封装在微球内部；所述聚苯乙烯纳米微球的直径为150～200nm。 8.根据权利要求6所述的单检测线的多指标时间分辨荧光免疫分析检测系统，其特征在于，所述50mM磷酸盐缓冲液的pH值为7.2～7.6；所述50mM MES缓冲液的pH值为5.0～6.0，所述碳二亚胺溶液和N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液均以所述50mM MES缓冲液配制。 9.根据权利要求6所述的单检测线的多指标时间分辨荧光免疫分析检测系统，其特征在于，所述探针储存液为含有10mg/mL的牛血清白蛋白、0.5wt％吐温-20及0.05wt％叠氮钠的50mM磷酸盐缓冲液。 10.一种通过如权利要求1～9任意一项的单检测线的多指标时间分辨荧光免疫分析检测系统进行的检测分析方法，其特征在于，按如下步骤进行： (1)配制含有BTA抗原、NMP-22抗原和CYFRA 21-1抗原的标准曲线工作液，至少配制五个不同浓度的工作液； (2)将一个浓度的所述标准曲线工作液与所述检测探针和质控探针溶液混合后，添加到所述检测试纸条的样品垫区域；将所述检测试纸条水平静置孵育10～20min后，插入荧光读数仪中，分别读取检测线T和质控线C处的铽元素、铕元素和钐元素对应的荧光信号，求得同种镧系元素荧光信号的T/C值； (3)重复步骤(2)，获得不同浓度下，铽元素、铕元素和钐元素对应的多个T/C值，分别建立铽元素、铕元素和钐元素对应的标准工作曲线； (4)以待测样品替代标准曲线工作液，按步骤(2)的操作，求得待测样品中铽元素、铕元素和钐元素对应的T/C值，利用步骤(3)建立的标准工作曲线，计算出待测样品中BTA抗原、抗NMP-22抗原和抗CYFRA 21-1抗原的浓度。
所属类别：	发明专利