详情

原文传递一种酶联免疫斑点检测试剂盒及其检测方法

专利名称：	一种酶联免疫斑点检测试剂盒及其检测方法
摘要：	本发明公开的一种酶联免疫斑点检测试剂盒，包括实验孔：包含anti‑CD28、IL‑2的培养基，多肽，细胞悬液；阴性对照：包含anti‑CD28、IL‑2的培养基，DMSO，细胞悬液；阳性对照：包含anti‑CD28、IL‑2的培养基，PMA+Ionomycin，细胞悬液；标准曲线：包含anti‑CD28、IL‑2的培养基，各浓度anti‑CD3，细胞悬液。其优点在于，提高酶联免疫斑点检测方法的灵敏度，并确保能够得到稳定可靠的检测结果。
专利类型：	发明专利
申请人：	北京立康生命科技有限公司
发明人：	陈立;贾明明;黎小珠;刘沙
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T00:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T00:00:00+0805
申请号：	CN201911403515.5
公开号：	CN111077311A
代理机构：	北京华专卓海知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	彭锐
分类号：	G01N33/569;G01N33/543;C12N5/078;G;C;G01;C12;G01N;C12N;G01N33;C12N5;G01N33/569;G01N33/543;C12N5/078
申请人地址：	100015 北京市朝阳区酒仙桥东路1号1幢1至4层102(411室)
主权项：	1.一种酶联免疫斑点检测试剂盒，其特征在于，包括实验孔：在实验孔内加入96μL待测PBMC细胞的培养基，4μL多肽，多肽中每条肽浓度为1-10μg/ml，以及100μL浓度为1-5×106/ml待测PBMC细胞悬液，终体积为200μL；该培养基中包含anti-CD28、IL-2，anti-CD28在该培养基中的浓度为0.1-5μg/ml，IL-2在该培养基中的浓度为1-30U/ml；阴性对照：在阴性对照孔内加入99μL待测PBMC细胞的培养基，1μL DMSO，以及100μL浓度为1-5×106/ml待测PBMC细胞悬液，终体积为200μL；该培养基中包含anti-CD28、IL-2，anti-CD28在该培养基中的浓度为0.1-5μg/ml，IL-2在该培养基中的浓度为1-30U/ml；阳性对照：在阳性对照孔内加入96μL待测PBMC细胞的培养基，4μL PMA+Ionomycin，以及100μL浓度为1-5×106/ml待测PBMC细胞悬液，终体积为200μL；该培养基中包含anti-CD28、IL-2，anti-CD28在该培养基中的浓度为0.1-5μg/ml，IL-2在该培养基中的浓度为1-30U/ml；含有anti-CD3梯度浓度的标准曲线：在各标准曲线孔分别加入95μL待测PBMC细胞的培养基，5μL各浓度anti-CD3，100μL浓度为1-5×106/ml待测PBMC细胞悬液，每个标准曲线孔内液体的终体积为200μL，得到多个含有anti-CD3梯度浓度的标准曲线孔；该培养基中包含anti-CD28、IL-2，anti-CD28在该培养基中的浓度为0.1-5μg/ml，IL-2在该培养基中的浓度为1-30U/ml；所述anti-CD3浓度的梯度设置为以0.001-0.005μg/ml浓度开始，连续倍比稀释。 2.根据权利要求1所述的酶联免疫斑点检测试剂盒，其特征在于，所述实验孔、阴性对照、阳性对照、标准曲线用到的待测PBMC细胞的培养基中还包含有IL-21，此培养基含有anti-CD28、IL-2、以及IL-21时，各成分在此培养基中的浓度为，anti-CD28为0.1-5μg/ml、IL-2为1-30U/ml、IL-21为10-50ng/ml。 3.根据权利要求1所述的酶联免疫斑点检测试剂盒，其特征在于，所述实验孔、阴性对照、阳性对照、标准曲线用到的待测PBMC细胞的培养基中还包含有IL-7，此培养基含有anti-CD28、IL-2、以及IL-7时，各成分在此培养基中的浓度为，anti-CD28为0.1-5μg/ml、IL-2为1-30U/ml、IL-7为1-30ng/ml。 4.根据权利要求1所述的酶联免疫斑点检测试剂盒，其特征在于，所述实验孔、阴性对照、阳性对照、标准曲线用到的待测PBMC细胞的培养基中还包含有IL-7、IL-15，此培养基含有anti-CD28、IL-2、IL-7、以及IL-15时，各成分在此培养基中的浓度为，anti-CD28为0.1-5μg/ml、IL-2为1-30U/ml、IL-7为1-30ng/ml、IL-15为1-50ng/ml。 5.一种采用权利要求1-4任意一项所述试剂盒酶联免疫斑点检测的方法，包括如下步骤： (1)将事先包被检测抗体的96孔ELISpot板从冰箱中取出，在安全柜中打开，每孔加入PBS洗涤； (2)向每孔中加入待测PBMC细胞的培养基，室温下孵育； (3)弃去96孔ELISpot板中的培养基，分别向实验孔、阴性对照孔、阳性对照孔、标准曲线对照孔加入所述试剂盒成分，即实验孔依次加入所述培养基、所述多肽、所述细胞悬液，终体积200μL；阴性对照孔依次加入所述培养基、所述DMSO、所述细胞悬液，终体积200μL；阳性对照孔中依次加入所述培养基，所述PMA+Ionomycin、所述细胞悬液，终体积200μL；各标准曲线孔依次加入所述培养基,所述各浓度anti-CD3、所述细胞悬液，终体积200μL； (4)将步骤(3)制备好的96孔ELISpot板放在CO2培养箱中37℃培养12-48小时； (5)12-48小时后将ELISpot板从培养箱中取出，倾倒孔内培养基，每孔加入200μL PBS洗涤，最后一次在吸水纸上扣干； (6)将检测抗体用PBS、FBS混合溶液稀释到1μg/mL，每孔加100μL，37℃孵育2小时，所述PBS在PBS、FBS混合溶液中的体积百分比为99.5％，余下为FBS； (7)倾倒孔内液体，每孔加入200μL PBS洗涤，最后一次在吸水纸上扣干； (8)将酶标亲和素用PBS、FBS混合溶液按体积比1：1000稀释后，每孔加100μL，37℃孵育1小时，所述PBS在PBS、FBS混合溶液中的体积百分比为99.5％，余下为FBS； (9)倾倒孔内液体，每孔加入200μL PBS洗涤，最后一次在吸水纸上扣干； (10)将显色液用0.45μm的滤膜过滤除杂质，然后每孔中加入100μL，室温避光孵育，每隔3-5min观察一次； (11)倾倒孔内液体，揭开板底座，用自来水洗涤正反面及底座，终止显色，将板放置在室温阴凉处，待其自然晾干后合上底座； (12)在酶联斑点图像分析仪上读取孔板膜片上的斑点； (13)根据各浓度anti-CD3读数制作标准曲线并拟合，将样本读数代入标准曲线求得修正后结果。 6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)之前还包括步骤(0)体外刺激： (01)用培养基将待测PBMC细胞浓度调整为2-8×106/ml； (02)在96孔U底细胞培养板中依次加入如下：实验孔：100μL待测PBMC细胞培养基、0.4μL多肽，多肽中每条肽浓度为1-10μg/ml、100μL浓度为2-8×106/ml待测PBMC细胞悬液，阴性孔：100μL待测PBMC细胞培养基、100μL浓度为2-8×106/ml待测PBMC细胞悬液； (03)将步骤(02)制备好的96孔U底细胞培养板放在CO2培养箱中37℃培养5天。
所属类别：	发明专利