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原文传递定量测定环境应激产生的体内/外超氧自由基含量的方法

专利名称：	定量测定环境应激产生的体内/外超氧自由基含量的方法
摘要：	本发明提供了一种定量测定环境应激产生的体内/外超氧自由基含量的方法，其包括如下步骤：步骤S1，制备供试品溶液：取待检样品，制成供试品溶液；步骤S2，制备对照品溶液：取标准品2,7‑二氯荧光素，溶于水，制成对照品溶液；步骤S3，采用高效液相色谱仪‑荧光检测器对供试品溶液和对照品溶液进行检测；步骤S4，以对照品溶液的峰面积为纵坐标，以对照品溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线，根据标准曲线计算供试品溶液中2,7‑二氯荧光素的含量，从而得到超氧自由基的含量。采用本发明的技术方案，可以对ROS进行定量的测量，减少了外界环境因素的干扰，使得不同批次之间具有可比性，方法简单可靠。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	广东;44
申请人：	维塔探索(广东)科技有限公司
发明人：	张根;李源真;杨柳;肖湘华;潘璐璐;欧阳嘉敏;张奎;王静;邹佳林
专利状态：	有效
申请日期：	2021-12-08T00:00:00+0800
发布日期：	2022-03-18T00:00:00+0800
申请号：	CN202111495383.0
公开号：	CN114200065A
代理机构：	深圳市科吉华烽知识产权事务所(普通合伙)
代理人：	胡吉科
分类号：	G01N30/06;G01N30/74;G;G01;G01N;G01N30;G01N30/06;G01N30/74
申请人地址：	528329 广东省佛山市顺德区均安镇均安社区智安北路19号世友制造园3栋404-A(住所申报)
主权项：	1.一种定量测定环境应激产生的体内/外超氧自由基含量的方法，其特征在于：其包括如下步骤：步骤S1，制备供试品溶液：取待检样品，制成供试品溶液；步骤S2，制备对照品溶液：取标准品2,7-二氯荧光素，溶于甲醇，制成对照品溶液；步骤S3，采用高效液相色谱仪-荧光检测器对供试品溶液和对照品溶液进行检测；步骤S4，以对照品溶液的峰面积为纵坐标，以对照品溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线，根据标准曲线计算供试品溶液中2,7-二氯荧光素的含量，从而得到超氧自由基的含量。 2.根据权利要求1所述的定量测定环境应激产生的体内/外超氧自由基含量的方法，其特征在于：步骤S3中，高效液相色谱仪采用的色谱柱为C18色谱柱；荧光检测器的激发波长为485 nm，发射波长为520 nm。 3.根据权利要求2所述的定量测定环境应激产生的体内/外超氧自由基含量的方法，其特征在于：步骤S3中，所述色谱柱为C18填料色谱柱，色谱柱直径介于2.1 mm-4.6 mm，长度为100-250 mm，填料的粒径为5μm；流动相为浓度为90%的甲醇水溶液，流速为1 mL/min，柱温为25-35℃。 4.根据权利要求2所述的定量测定环境应激产生的体内/外超氧自由基含量的方法，其特征在于：步骤S3中的液相色谱分析仪中，流动相A为甲醇，流动相B为pH=7.5的PBS缓冲液，A：B=62：38等度洗脱，流速为1mL/min，柱温为30℃，进样量为20μL。 5.根据权利要求2所述的定量测定环境应激产生的体内/外超氧自由基含量的方法，其特征在于：步骤S1中，供试品溶液采用如下步骤配制：步骤S101，向待测生物所生活的培养基或所食用中加入引起生物体产生超氧自由基或者引起氧化伤害的物质，经过光照处理，按照生物体的自身培养条件培养30 min或以上，再加入2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯，待2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯进入细胞内，继续培养，收集生物体或其特定组织，研磨破碎，加入萃取溶剂对产生的2,7-二氯荧光素进行萃取，离心后，获得上清液；步骤S102，对上清液进行浓缩，再用甲醇溶液复溶，过滤后作为供试品溶液。 6.根据权利要求5所述的定量测定环境应激产生的体内/外超氧自由基含量的方法，其特征在于：步骤S101还包括：在获得的上清液中，加入氯仿后震荡离心，收集上清液；步骤S101中的萃取溶剂为甲醇或者乙醇。 7.根据权利要求5所述的定量测定环境应激产生的体内/外超氧自由基含量的方法，其特征在于：步骤S102中，对上清液采用旋转蒸发、离心浓缩干燥或冷冻干燥进行浓缩，过滤采用0.22 μm滤膜。 8.根据权利要求5所述的定量测定环境应激产生的体内/外超氧自由基含量的方法，其特征在于：所述待测生物为体外培养的细胞、细菌、酵母、浮游动物、藻类、鱼类，将待测生物按照常规培养方法进行培养。 9.根据权利要求1所述的定量测定环境应激产生的体内/外超氧自由基含量的方法，其特征在于：步骤S1中，供试品溶液采用如下步骤配制：向待测样品中加入甲醇、丙酮或二甲基亚砜助溶的2,7-二氯二氢荧光素溶液，按照待测样品的要求进行处理后，取部分液体使用离心浓缩干燥或冷冻干燥进行浓缩，再经过0.22 μm滤膜过滤后，得到供试品溶液；其中，所述待测样品中含有引起生物体产生超氧自由基或者引起氧化伤害的物质。 10.根据权利要求9所述的定量测定环境应激产生的体内/外超氧自由基含量的方法，其特征在于：所述待测样品中含有纳米二氧化钛，在向待测样品中加入2,7-二氯二氢荧光素的丙酮溶液后，采用氙灯或LED灯进行光照处理。
所属类别：	发明专利