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原文传递血液循环肿瘤细胞病理芯片的制作方法

专利名称：	血液循环肿瘤细胞病理芯片的制作方法
摘要：	本发明涉及血液循环肿瘤细胞病理芯片的制作方法。具体地，本发明涉及对血液样品中的循环肿瘤细胞进行液基染色，然后将其制作在病理切片中进行检测。本发明还涉及用于执行上述方法的病理芯片。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	北京;11
申请人：	王剑
发明人：	楚文江;王剑
专利状态：	有效
申请日期：	2020-08-27T00:00:00+0800
发布日期：	2022-03-01T00:00:00+0800
申请号：	CN202010877977.7
公开号：	CN114112605A
代理机构：	中国专利代理(香港)有限公司
代理人：	李波;李唐
分类号：	G01N1/30;G01N1/34;G01N1/28;G01N21/84;G;G01;G01N;G01N1;G01N21;G01N1/30;G01N1/34;G01N1/28;G01N21/84
申请人地址：	100050 北京市西城区北纬路49号3号楼东门12号
主权项：	1.对要制作病理芯片的循环肿瘤细胞（CTC）进行免疫组化染色和/或核酸显色原位杂交染色以及可用来病理学诊断的细胞形态学染色的多重染色方法，包括： a）在容器中稀释沉淀的循环肿瘤细胞，制备细胞悬液； b) 在所述容器中的所述细胞悬液中，对所述细胞进行免疫组化染色和/或核酸显色原位杂交染色，包括： i) 在所述细胞悬液中加入特异性结合所述细胞上的抗原和/或核酸标志物的第一抗体和/或第一核酸探针，完成所述第一抗体和/或第一核酸探针与所述抗原和/或核酸标志物的特异性结合； ii) 去除未结合的所述第一抗体和/或第一核酸探针，然后重新制备细胞悬液， iii) 在所述细胞悬液中加入缀合了显色酶的第二抗体和/或显色酶标记的第二核酸探针，使其特异性结合第一抗体和/或第一核酸探针； iv) 去除未结合的所述缀合了显色酶的第二抗体和/或显色酶标记的第二核酸探针，然后重新制备细胞悬液， v) 在所述细胞悬液中加入显色底物进行显色，在显色过程中，不断震荡悬浮在液体中的细胞，使催化产生的显色沉淀产物均匀散开而避免集中堆积；以及 vi) 去除多余的显色底物，然后重新制备细胞悬液；以及 c) 在所述容器中对所述细胞进行可用来病理诊断的细胞形态学染色，然后将多重染色的细胞涂布到病理玻片上；或者，将经过免疫组化染色和/或核酸显色原位杂交染色的细胞涂布到病理玻片上，进行可用来病理诊断的形态学染色。 2.权利要求1所述的方法，其中步骤ii)、iv)和vi)中去除未结合的所述第一抗体和/或第一核酸探针、去除未结合的所述缀合了显色酶的第二抗体和/或显色酶标记的第二核酸探针和去除多余的显色底物通过以下步骤： i)清洗细胞； ii)离心沉淀细胞；和 iii)丢弃上清液。 3.权利要求1或2所述的方法，其中所述可用来病理学诊断的细胞形态学染色选自Diff-Quik染色、巴氏（Papanicolaou）、瑞氏-吉姆萨（Wright-Giemsa）染色，和H&E染色，优选Diff-Quik染色。 4.用于在显微镜下观察循环肿瘤细胞CTC的芯片，该芯片包括： a）载玻片，其表面涂布了用于吸附CTC的细胞吸附材料； b）盖玻片，其中包含了微流通道，微流通道具有突出或凹陷的入液口和出液口阀门；和 c) 肿瘤细胞通过微流通道涂布在含有细胞吸附材料的载玻片后，在微流通道中填充的透明填充液体，所述填充液体避免微流通道造成的透镜效应，保障光学显微镜的光学路径通畅，从而可以在显微镜下观察CTC的个数、形态学特点，和免疫组化和/或显色原位杂交的染色结果。 5.权利要求4的芯片，其中所述载玻片的大小是常规大小，例如约75毫米 X 25毫米。 6.权利要求4或5的芯片，其中载玻片中约40-50 X 20-25毫米的椭圆或者矩形区域包含细胞吸附材料。 7.权利要求4-6的任一项的芯片，其中细胞吸附材料是纳米材料，如100-200纳米的粗糙表面。 8.权利要求4-7的任一项的芯片，其中盖玻片的大小是约40-50 X 20-25毫米，厚度约0.15-0.25毫米。 9.权利要求4-8的任一项的芯片，其中微流通道为约0.5-1.5毫米宽，约50-100微米高。 10.权利要求4-9的任一项的芯片，其中微流通道可以是蛇形单通道，或者直行的多通道。 11.权利要求4-10的任一项的芯片，其中入液口和出液口阀门部位突出的高度是约0.4-0.8厘米。 12.权利要求4-11的任一项的芯片，其中所述填充液体包含以下成分： a）α-蒎烯； b）Toluene；和 c）2,6-二叔丁基对甲酚。 13.权利要求12的芯片，其中a)、b)、c)三种成分的重量百分比分别是25%-60%、40%-70%和1-3%，优选分别是27.5%、71.5%和1.0%。 14.芯片组，其包含两个或更多个相互串联的权利要求4-13的任一项的芯片。 15.制作循环肿瘤细胞(CTC)病理芯片的方法，包括： a）将包含染色的循环肿瘤细胞和部分存留的白细胞的液体，通过权利要求4-13的任一项所述载玻片上的入液口泵入权利要求4-13的任一项所述的芯片的微流通道；任选地，该步骤使用两个或更多个相互串联的权利要求4-13的任一项的芯片； b）液体通过微流通道后，经出液口流出，CTC吸附在载玻片的吸附材料上，形成单层细胞吸附层； c）在微流通道中透明填充液体填充微流通道，保障光学显微镜的光学路径通畅，从而可以在显微镜下观察CTC的个数、形态学特点，和免疫组化或/和显色原位杂交染色结果。 16.制作循环肿瘤细胞(CTC)病理芯片的方法，包括： i）对要制作病理芯片的血液样品进行预处理，得到富含所需要的循环肿瘤细胞的沉淀物; ii）对步骤i) 获得的循环肿瘤细胞进行液基的免疫组化或/和显色原位杂交染色；和 iii）制作病理芯片，包括： a）将包含染色的循环肿瘤细胞和部分存留的白细胞的液体，通过权利要求4-11的任一项所述载玻片上的入液口泵入权利要求4-11的任一项所述的芯片的微流通道；任选地，该步骤使用两个或更多个相互串联的权利要求4-11的任一项的芯片； b）液体通过微流通道后，经出液口流出，CTC吸附在载玻片的吸附材料上，形成单层细胞吸附层； c）在微流通道中透明填充液体填充微流通道，保障光学显微镜的光学路径通畅，从而可以在显微镜下观察CTC的个数、形态学特点，和免疫组化或/和显色原位杂交染色结果。 17.权利要求16的方法，其中步骤i)包括 a）去掉样品中的红细胞和血小板； b）加入抗CD45单克隆抗体，所述抗体与白细胞表面的CD45特异结合，产生CD45抗原-抗体复合物； c）在样品中加入含有补体的组合物，补体被白细胞表面的CD45抗原-CD45抗体复合物激活后，在白细胞膜上打孔，使得白细胞膨胀破裂；和 d）离心样品，得到富含所需要的循环肿瘤细胞的沉淀物。 18.权利要求16的方法，其中步骤ii)包括： a）稀释沉淀的循环肿瘤细胞，制备细胞悬液； b）在所述细胞悬液中，加入可以增加细胞膜通透性的试剂； c）加入特异性结合所述肿瘤细胞上的抗原的第一抗体，完成特异性抗原抗体结合； d）加入缀合了显色酶的第二抗体,其特异性结合第一抗体；和 e）加入显色剂进行显色；或者步骤ii)是通过权利要求1-3的任一项的方法进行的。 19.权利要求16-18的任一项的方法，其中所述填充液体包含以下成分： a）α-蒎烯； b）Toluene；和 c）2,6-二叔丁基对甲酚。 20.权利要求19的方法，其中a)、b)、c)三种成分的重量百分比分别是25%-60%、40%-70%和1-3%，优选分别是27.5%、71.5%和1.0%。
所属类别：	发明专利