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原文传递一种鲤疱疹病毒II型抗体胶体金检测试纸条及其制备方法和应用

专利名称：	一种鲤疱疹病毒II型抗体胶体金检测试纸条及其制备方法和应用
摘要：	本发明属于分子体外诊断技术领域，具体涉及一种鲤疱疹病毒II型抗体胶体金检测试纸条及其制备方法和在鲤科鱼类感染疱疹病毒II型(CyHV‑2)病毒的检测和鲤科鱼类IgM抗体水平的监测的应用。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	上海;31
申请人：	上海海洋大学
发明人：	孙瑜翀;吕利群;张小米;计晓花
专利状态：	有效
申请日期：	2023-06-12T00:00:00+0800
发布日期：	2023-11-10T00:00:00+0800
申请号：	CN202310688551.0
公开号：	CN117031005A
代理机构：	上海伯瑞杰知识产权代理有限公司
代理人：	简丹
分类号：	G01N33/543;G01N33/532;G01N33/569;G01N33/58;G;G01;G01N;G01N33;G01N33/543;G01N33/532;G01N33/569;G01N33/58
申请人地址：	201306 上海市浦东新区沪城环路999号
主权项：	1.一种鲤疱疹病毒II型抗体胶体金检测试纸条，包括载体(1)、固定在所述载体(1)上的硝酸纤维膜(2)、用于承载胶体金的金标垫(4)和用于承载样品溶液的样品垫(5)，所述硝酸纤维膜(2)上包覆有间隔设置的检测线(21)和质控线(22)，其特征在于，所述金标垫(4)包括含有胶体金溶液和鲤疱疹病毒II型病毒液的金标抗原溶液，所述检测线(21)包括Protein A，所述质控线(22)包括兔源rORF66多克隆抗体。 2.一种如权利要求1所述的鲤疱疹病毒II型抗体胶体金检测试纸条的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：扩增鲤疱疹病毒II型(CyHV-2)病毒，获得CyHV-2病毒液；制备鲫鱼阳性血清；制备胶体金溶液；制备胶体金标记CyHV-2病毒抗原溶液；确定质控线最适划线浓度；确定检测线最适划线浓度；组装试纸条。 3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，扩增鲤疱疹病毒II型(CyHV-2)病毒的步骤包括：将保存在-150℃的CyHV-2病毒化冻，选取在27℃细胞培养箱生长1-2天的鲫鳍条细胞系(GiCF)细胞，用显微镜观察生长状态，细胞长为单层且状态较好时，开始接种病毒；先用移液管吸出T75培养瓶中的培养液，加入化冻的CyHV-2病毒液，25℃孵育2h，然后吸出病毒液，加入含2％胎牛血清的M199培养基；放置于25℃细胞培养箱，待出现细胞病变效应，继续培养1-2天，使病毒充分释放于培养液中；用离心管收集病毒液并在800rpm离心5min，以此去除细胞碎片，上清液使用0.22μm过滤膜过滤，提取DNA进行qPCR以确定病毒载量，病毒保存至-150℃冰箱备用。 4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，制备鲫鱼阳性血清的步骤包括：将长度为14-16cm的健康鲫鱼暂养7天，确认无病毒或其他病原感染，取10条鲫鱼，每条鲫鱼腹腔注射500μL 109copies/mL的CyHV-2病毒液，然后放入20L曝氧水以及保持25℃温度的玻璃缸；待21天后每条鲫鱼尾静脉抽血，血液放入离心管中，4℃静置一夜；然后解剖鲫鱼，取肾、脾、肝胰脏，提取病毒DNA并进行PCR，产物使用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，组织保存于-20℃；第二天将血样品800rpm离心5min，吸取血清移入新的离心管中，吸取的血清进行DotBlot检测抗体效价，血清保存于-20℃。 5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述鲫鱼阳性血清的抗体效价为1：320。 6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，制备胶体金溶液的步骤包括：首先将玻璃容器清洗干净，加入浓度为0.01％的氯金酸溶液，置于加热磁力搅拌器上加热搅拌，待溶液彻底煮沸3min后迅速加入1％柠檬酸三钠溶液，搅拌并持续加热，溶液变黑再变紫红色后，继续加热10min待反应完全，待冷却后补充到原体积，此时溶液呈酒红色，用分光光度计以及透射电镜进行质量鉴定，得到胶体金颗粒的平均粒径在15-25nm的胶体金溶液。 7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，制备胶体金标记CyHV-2病毒抗原溶液的步骤包括：用0.2mol/L K2CO3溶液将6管胶体金溶液分别调节pH至4～9，在不同pH溶液中加入适量的CyHV-2病毒液，充分混合均匀静置30min后，加入10％NaCl溶液，混合均匀静置2h，使用分光光度计测定每个pH梯度在520nm处的OD值；将6管胶体金溶液调节至最适pH，分别向胶体金溶液中加入15μL、30μL、45μL、60μL、75μL、90μL的CyHV-2病毒液，混合均匀后静止30min，随即加入0.1mL 10％NaCl溶液混合均匀后，静置2h，使用分光光度计检测每个浓度在520nm处OD值；取800μL胶体金溶液于离心管中，将离心管置于冰上操作，调节至最适pH，涡旋3min，静置3min；向胶体金溶液中加入最适标记量120％的CyHV-2病毒液，涡旋3min，静置3min；加入5％BSA溶液(1x PBS配置)使BSA终浓度为1％，涡旋3min，静置3min；然后在4℃下，1500rpm离心20min；观察无沉淀则效果良好，继续4℃，8000～9900rpm离心30min；此时胶体金沉淀于底部，吸除上清，沉淀取用1/10体积作为金标复溶液重悬，保存至4℃。 8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，确定质控线最适划线浓度的步骤包括：取硝酸纤维素膜，将兔源rORF66多克隆抗体稀释成1.0、0.8、0.6、0.4、0.2mg/mL依次划线，组装成试纸条，检测阴性血清和阳性血清，15min后根据显色情况确定质控线最适划线浓度。 9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，确定检测线最适划线浓度：取硝酸纤维素膜，将Protein A稀释成1.0、0.8、0.6、0.4、0.2mg/mL依次划线，组装成试纸条，检测阴性血清和阳性血清，15min后根据显色情况确定检测线最适划线浓度。 10.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，组装试纸条的步骤包括：步骤(1)、将金标垫用裁条机切割成9mm的细条，用0.01mol/L含2％Tween-20、5％海藻糖的PBS缓冲液的预处理液(pH＝7.4)浸泡30min，37℃干燥箱烘干1h，收于干燥袋中备用；步骤(2)、将样品垫用裁条机切割成15mm的细条，用0.01mol/L含0.2％TritionX-100的PBS缓冲液的预处理液(pH＝7.4)浸泡30min，37℃干燥箱烘干1h，收于干燥袋中备用；步骤(3)、将吸水纸用裁条机切割成17mm的细条，收于干燥袋中备用；步骤(4)、用XYZ三维划膜喷金仪对硝酸纤维素膜进行划线，用Protein A溶液在检测线处划线，用rORF66多克隆抗体在质控线处划线，置于37℃干燥箱干燥1h；步骤(5)、用制备好的金标抗原溶液滴加到金标垫上，浸润金标垫，置于37℃干燥箱干燥1h；步骤(6)、取PVC底板置于贴条机上，依次组装，重叠2mm固定在PVC底板上，将贴好的试纸板用裁条机切成4.2mm宽的试纸条。 11.如权利要求1所述的鲤疱疹病毒II型抗体胶体金检测试纸条在鲤科鱼类感染疱疹病毒II型(CyHV-2)病毒的检测和鲤科鱼类IgM抗体水平的监测的应用。 12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述鲤疱疹病毒II型抗体胶体金检测试纸条检测的最低限度为1：100稀释的CyHV-2阳性血清抗体。