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原文传递一种英夫利西的检测试剂及其制备方法和检测方法与应用

专利名称：	一种英夫利西的检测试剂及其制备方法和检测方法与应用
摘要：	本申请涉及游离药物检测技术领域，具体公开一种英夫利西的检测试剂及其制备方法和检测方法与应用。该英夫利西的检测试剂的制备方法包括：制备英夫利西（Fab）2片段作为抗原，引发免疫反应，筛选捕获抗体和检测抗体；取捕获抗体和链霉亲和素磁珠反应得到磁微粒工作液；取检测抗体和碱性磷酸酶偶联反应得到酶标工作液；磁微粒工作液、酶标工作液和发光指示剂作为英夫利西的检测试剂；催化酶能催化发光指示剂发光。磁微粒工作液可以先和抗原反应结合，再加入酶标工作液和已结合在磁微粒上的抗原结合，最后加入发光指示剂进行显色，通过设计两种抗体均要能结合抗原，达到特异性筛选抗原的效果，通过发光参数得出抗原的准确浓度。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	北京;11
申请人：	北京丹大生物技术有限公司
发明人：	张望;周裕军;周建平;吴鸣月;王艳新
专利状态：	有效
申请日期：	2023-08-16T00:00:00+0800
发布日期：	2023-11-17T00:00:00+0800
申请号：	CN202311033049.2
公开号：	CN117074693A
代理机构：	北京维正专利代理有限公司
代理人：	鲁勇杰
分类号：	G01N33/68;G01N33/543;G01N33/535;G;G01;G01N;G01N33;G01N33/68;G01N33/543;G01N33/535
申请人地址：	101149 北京市通州区北京经济技术开发区(通州)环科中路2号院19号楼1至3层101
主权项：	1.一种英夫利西的检测试剂的制备方法，其特征在于，包括：制备英夫利西（Fab）2片段作为抗原；使用所述抗原引发免疫反应，筛选得到能与所述抗原结合的捕获抗体和检测抗体；取所述捕获抗体和链霉亲和素磁珠反应得到磁微粒工作液；取所述检测抗体和催化酶偶联反应得到酶标工作液；所述磁微粒工作液、所述酶标工作液和发光指示剂作为所述英夫利西的检测试剂；所述催化酶能催化所述发光指示剂发光。 2.根据权利要求1所述的英夫利西的检测试剂的制备方法，其特征在于，所述制备英夫利西（Fab）2片段，包括：将英夫利西溶解，加入（Fab）2特异性剪切酶，孵育，去除未反应的英夫利西，去除从英夫利西切割下的Fc段以及去除所述（Fab）2特异性剪切酶，收集含有英夫利西（Fab）2片段的剩余物；所述（Fab）2特异性剪切酶为IdeZ蛋白酶、IdeS蛋白酶或胃蛋白酶。 3.根据权利要求2所述的英夫利西的检测试剂的制备方法，其特征在于：将英夫利西和（Fab）2特异性剪切酶孵育后的液体先通过抗体纯化柱，来去除未反应的英夫利西和去除从英夫利西中切割下的Fc片段，再通过Ni亲和层析柱，来去除所述（Fab）2特异性剪切酶。 4.根据权利要求1所述的英夫利西的检测试剂的制备方法，其特征在于，筛选得到所述捕获抗体和所述检测抗体，包括：取英夫利西（Fab）2片段，加入弗氏完全佐剂，得到第一乳化液，将所述第一乳化液注入试验动物体内进行首次免疫；继续取英夫利西（Fab）2片段，加入弗氏不完全佐剂，得到第二乳化液，将所述第二乳化液再次注入所述试验动物体内，持续2~10天进行增强免疫；所述首次免疫到所述增强免疫的时间间隔为2~6周，并重复3~6次所述增强免疫，相邻两次所述增强免疫的时间间隔为2~6周；取得所述试验动物体内的免疫脾细胞，取骨髓瘤细胞，将所述免疫脾细胞和所述骨髓瘤细胞融合，得到融合细胞，进行培养，得到培养液；以所述英夫利西（Fab）2片段为抗原，以所述培养液的上清液为抗体来源，采用酶联免疫吸附测定方法筛选出抗英夫利西的所述捕获抗体和所述检测抗体。 5.根据权利要求4所述的英夫利西的检测试剂的制备方法，其特征在于，采用酶联免疫吸附测定方法筛选出抗英夫利西的所述捕获抗体和所述检测抗体，包括：先对所述培养液的上清液进行效价测定，对效价检测阳性的克隆再进行竞争性筛选，竞争性筛选采用所述英夫利西（Fab）2片段包被基体，再加入肿瘤坏死因子TNF-α，以及所述培养液的上清液；选取细胞效价测定强阳性，同时竞争性筛选弱阳性或阴性的克隆，筛选到多个竞争性抗英夫利西独特型抗体；将每个所述抗英夫利西独特型抗体和辣根过氧化物酶HRP偶联，得到多个偶联试剂；将每个所述抗英夫利西独特型抗体包被基体，再加入英夫利西，反应后清洗基体，再加入任意一种所述偶联试剂，接着加入四甲基联苯胺TMB进行显色反应，采用酶标仪读取光数据，选择信噪比最高的两种抗体为捕获抗体和检测抗体。 6.一种英夫利西的检测试剂，其特征在于，根据权利要求1-5任意一项所述的制备方法所制备得到；所述检测试剂包括所述磁微粒工作液、所述酶标工作液和所述发光指示剂。 7.根据权利要求6所述的英夫利西的检测试剂，其特征在于，所述催化酶是碱性磷酸酶；所述发光指示剂是AMPPD。 8.一种英夫利西的检测方法，其特征在于，采用权利要求6或7所述的检测试剂来检测英夫利西；所述检测方法包括：采用未经过英夫利西药物治疗的人血清基质配置多个不同浓度的英夫利西的校准品，每个所述校准品均加入所述磁微粒工作液、所述酶标工作液和所述发光指示剂，孵育反应，得到多个反应液，检测每个所述反应液的相对光单位RLU，以英夫利西浓度和RLU分别为横坐标和纵坐标，使用多个所述校准品的英夫利西浓度一一对应多个测试得到的RLU来制作得到标准曲线；在检测样品中加入所述磁微粒工作液、所述酶标工作液和所述发光指示剂，孵育反应，得到测试液，检测所述测试液的RLU，将所述测试液的RLU代入所述标准曲线，得到所述检测样品的英夫利西浓度。 9.根据权利要求8所述的英夫利西的检测方法，其特征在于，所述标准曲线的获得，具体包括：采用未经过英夫利西药物治疗的人血清基质配置英夫利西浓度分别为0μg/mL、0.5μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、20μg/mL、50μg/mL的校准品；将链霉亲和素磁珠稀释在硼酸缓冲液中，加入所述捕获抗体，在35~39℃中震荡反应6~10h，再清除未和所述链霉亲和素磁珠结合的所述捕获抗体，得到所述磁微粒工作液；将催化酶溶解在磷酸盐缓冲溶液中，加入所述检测抗体，加入偶联剂，所述催化酶、所述检测抗体和所述偶联剂的质量比为1：0.2~1：0.2~1；混匀1~3h，进行透析，以去除未偶联的所述检测抗体和未反应的所述偶联剂，得到含有所述检测抗体和催化酶偶联产物的所述酶标工作液；在每个浓度的所述标准品中加入所述磁微粒工作液，进行反应3~7min后再进行清洗，然后加入所述酶标工作液，在35~39℃中孵育3~7min，清洗，加入发光指示剂进行显色，检测相对光单位RLU，得到了所述标准曲线，Y = (A - D) / [1 + (X/C)B] + D，其中A=11316.58691，B=0.95356274，C=68.40270996，D=10870328，相关系数R2为0.997。 10.如权利要求8或9所述的英夫利西的检测方法，其特征在于，应用于检测血液中游离的英夫利西浓度。