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原文传递一种总25-羟基维生素D检测试剂盒及其制备方法与使用方法

专利名称：	一种总25-羟基维生素D检测试剂盒及其制备方法与使用方法
摘要：	本发明公开了一种总25‑羟基维生素D检测试剂盒及其制备方法与使用方法。本发明的总25‑羟基维生素D检测试剂盒可以方便、快速、准确地确定血清、血浆、全血、尿液、唾液、母乳等生理样本中的25‑羟基维生素D含量，并且可以在全自动生化分析仪上同时测定多个样本，实现25‑羟基维生素D的高通量、快速化测定，准确度高，特异性强，精确度和检测效率相比之前都有了较大的提高，同时实现了检测过程的全自动化。本发明的总25‑羟基维生素D检测试剂盒具有操作简便、灵敏度高、结果准确等优点，对检测人员的要求不高，还能有效降低25‑羟基维生素D检测成本，易于实现和大规模推广使用。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	湖南;43
申请人：	长沙博源医疗科技有限公司
发明人：	茹庆科;李冬;蔡江丽;封飒飒;陆丽华
专利状态：	有效
申请日期：	2023-07-24T00:00:00+0800
发布日期：	2023-11-10T00:00:00+0800
申请号：	CN202310905472.0
公开号：	CN117031045A
分类号：	G01N33/82;G01N33/577;G01N33/58;G01N33/535;G;G01;G01N;G01N33;G01N33/82;G01N33/577;G01N33/58;G01N33/535
申请人地址：	410300 湖南省长沙市浏阳经济技术开发区湘台路18号长沙E中心二期A5栋3层302号房
主权项：	1.一种总25-羟基维生素D检测试剂盒，其特征在于，含有抗25-羟基维生素D特异性抗体和标记免疫检测试剂，所述的标记免疫检测试剂选自酶标记免疫检测试剂、化学发光标记免疫检测试剂、放射性同位素标记免疫检测试剂、荧光标记免疫检测试剂或胶乳微球标记免疫检测试剂中的一种，优选为酶标记免疫检测试剂，所述的酶标记免疫检测试剂为25-羟基维生素D均相酶免疫检测试剂。 2.根据权利要求1所述的总25-羟基维生素D检测试剂盒，其特征在于，所述的25-羟基维生素D均相酶免疫检测试剂，由R1试剂与R2试剂组成，所述R1试剂包含抗25-羟基维生素D特异性抗体与R1缓冲液，所述R2试剂包含25-羟基维生素D葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物与R2缓冲液；所述的抗25-羟基维生素D特异性抗体为鼠抗人25-羟基维生素D单克隆抗体；所述的R1缓冲液含有酶底物、辅酶、牛血清白蛋白及Tris缓冲液，所述的酶底物为葡萄糖-6-磷酸，所述的辅酶为β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型；所述的25-羟基维生素D葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物由25-羟基维生素D衍生物与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶偶联而成；其结构式如式Ⅰ所示：式Ⅰ；所述25-羟基维生素D衍生物的结构式如式Ⅱ所示：式Ⅱ；所述的R2缓冲液为含有牛血清白蛋白的Tris缓冲液。 3.根据权利要求1-2任一项所述的总25-羟基维生素D检测试剂盒，其特征在于，所述25-羟基维生素D均相酶免疫检测试剂的制备方法包含以下步骤：（A1）R1试剂：将2.018～8.072g浓度为5.625～22.50 mMβ-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型和0.856～3.422g浓度为5.625～22.50 mM葡萄糖-6-磷酸用0.5～2 L 浓度为55 mM、pH为8.0的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物溶液，将权利要求2中所述的抗25-羟基维生素D特异性抗体加到上述均相酶底物溶液中，抗25-羟基维生素D特异性抗体与均相酶底物溶液的体积比为1∶100～1∶10000，所述的抗25-羟基维生素D特异性抗体与均相酶底物溶液的体积比优选为1∶1000；（A2）R2试剂：将25-羟基维生素D酶标偶联物加到浓度为120mM、pH为8.2的Tris缓冲液中，25-羟基维生素D酶标偶联物与Tris缓冲液的体积比为1∶100～1∶10000，所述的25-羟基维生素D酶标偶联物与Tris缓冲液的体积比优选为1∶3000。 4.根据权利要求2所述的总25-羟基维生素D检测试剂盒，其特征在于，所述的25-羟基维生素D葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物的制备方法包含以下步骤：（B1）葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液的制备：将5-25mg的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，3-15mgMgCl2和30-150mg NaCl混合溶解于5-25mL浓度为1mol/L、pH=6.8的Tris缓冲液中；再加入100-500mg还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，50-250mg葡萄糖-6-磷酸，0.3-1.5mL卡必醇和1-5mL二甲基亚砜，搅拌溶解，得到葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液；（B2）25-羟基维生素D衍生物溶液的制备：将3-15mg权利要求2中式Ⅱ所示的25-羟基维生素D衍生物溶解于300-1500µL二甲基甲酰胺中，降温至-18℃，加入1.5-7.5µL三丁胺和1-5µL氯甲酸异丁酯，低温搅拌混匀，得到25-羟基维生素D衍生物溶液；（B3）25-羟基维生素D葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物的合成：将步骤（B2）得到的25-羟基维生素D衍生物溶液逐滴加入到步骤（B1）得到的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中，2-8℃搅拌反应过夜，经G-50葡聚糖凝胶层析柱纯化，得到25-羟基维生素D葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物。 5.根据权利要求1-2任一项所述的总25-羟基维生素D检测试剂盒，其特征在于，所述25-羟基维生素D均相酶免疫检测试剂的使用方法包括以下步骤：（1）在全自动生化分析仪中加入待测样本、R1试剂，混匀，37℃温育3-5分钟；（2）加入R2试剂，混匀，37℃恒温5-10分钟后，340 nm波长进行检测，连续监测3分钟内的吸光度变化率，由全自动生化分析仪自动计算待测样本中25-羟基维生素D的含量；其中，所述的待测样本为生理样本，优选地，所述的生理样本为血清、血浆、尿液、唾液，更优选地，所述的生理样本为血清或血浆；所述R1试剂与R2试剂按1∶1～4∶1的体积比使用，优选地，按4∶1的体积比使用。