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原文传递同时检测人末梢血中25-羟基维生素D3和25-羟基维生素D2含量的方法

专利名称：	同时检测人末梢血中25-羟基维生素D3和25-羟基维生素D2含量的方法
摘要：	本发明提供了同时检测人末梢血中25‑羟基维生素D3和25‑羟基维生素D2含量的方法，该方法为：利用高效液相串联质谱仪检测至少三个标准溶液得到相应色谱图，标准溶液中含浓度已知的两维生素及各自的内标物；根据标准溶液中维生素与其内标物的浓度比值、色谱图中两者的峰面积比值，拟合出各个维生素的标准曲线方程；处理待检测末梢血液得到血液样品，并加入浓度已知的两种内标物，经样品前处理以得到待测样品；在相同检测条件下检测待测样品得到其色谱图；将该色谱图中维生素及其内标物的峰面积比值代入到相应标准曲线方程，并根据所添加的其内标物的浓度，计算待检测血液中各个维生素的含量。本发明能够同时检测人末梢血中两维生素的含量。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	北京;11
申请人：	北京和合医学诊断技术股份有限公司
发明人：	杨缓缓;雒琴;贾永娟;倪君君
专利状态：	有效
申请日期：	2019-07-12T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-06T00:00:00+0800
申请号：	CN201910629519.9
公开号：	CN110208435A
代理机构：	济南信达专利事务所有限公司
代理人：	李世喆
分类号：	G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	101111 北京市北京经济技术开发区经海六路5号院14号楼1层、2层、3层、5层、6层、7层
主权项：	1.同时检测人末梢血中25-羟基维生素D3和25-羟基维生素D2含量的方法，其特征在于，包括：利用高效液相串联质谱仪，在一定检测条件下，分别检测至少三个标准溶液，得到各个标准溶液的色谱图，其中，任一标准溶液中均含有浓度已知的25-羟基维生素D3及其内标物和25-羟基维生素D2及其内标物，不同标准溶液中同一维生素的浓度不同；以标准溶液中，一维生素的浓度与其内标物的浓度的比值为一二维坐标，以及以该标准溶液的色谱图中，该维生素的峰面积与其内标物的峰面积的比值为另一二维坐标，拟合得到该维生素的标准曲线方程，从而得到25-羟基维生素D3的标准曲线方程和25-羟基维生素D2的标准曲线方程；处理待检测末梢血液得到血液样品；将一定量的混合内标工作液添加到所述血液样品中，并进行样品前处理以得到待测样品，其中，所述混合内标工作液中含有浓度已知的25-羟基维生素D3的内标物和25-羟基维生素D2的内标物；利用高效液相串联质谱仪，在相同检测条件下，检测所述待测样品，得到所述待测样品的色谱图；将所述待测样品的色谱图中，一维生素的峰面积与其内标物的峰面积的比值，代入到该维生素的标准曲线方程中，并根据所添加的其内标物的浓度，计算出所述待检测末梢血液中该维生素的含量，从而得到所述待检测末梢血液中25-羟基维生素D3的含量和25-羟基维生素D2的含量；其中，维生素的标准曲线方程为：y＝k×x+b，其中，y表征峰面积比值，x表征浓度比值，k和b均表征系数。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测条件包括：液相条件和串联质谱条件；其中，所述液相条件包括：色谱柱的长度为50mm、内径为3.0mm、填料粒径为2.7μm；流动相为含体积比为0.05％-0.25％甲酸的水，和，含体积比为0.05％-0.25％甲酸及浓度为0.5mmol/L-2.5mmol/L的甲酸铵的甲醇；分析时间为5.0min；柱温为20℃-30℃；进样量为0.1μl-30μl；流速为0.55mL/min-0.65mL/min；其中，所述串联质谱条件包括：采用大气压化学电离源ESI，正离子扫描模式，选择反应监测模式，雾化气流速为3L/min，加热气流速为10L/min，接口温度为300℃，DL温度为150℃，加热模块温度为400℃。 3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述液相条件还包括：Poroshell 120-PFP色谱柱；和/或，所述液相条件还包括：流动相为含体积比为0.1％甲酸的水，和，含体积比为0.1％甲酸及浓度为1.0mmol/L的甲酸铵的甲醇；和/或，所述液相条件还包括：洗脱过程为：含体积比为0.05％-0.25％甲酸的水，和，含体积比为0.05％-0.25％甲酸及浓度为0.5mmol/L-2.5mmol/L的甲酸铵的甲醇，的百分用量比，在2.81min-3.80min的洗脱时间范围内为0：100，在其他洗脱时间范围内为26:74。 4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述处理待检测末梢血液得到血液样品，包括：取至少0.2mL的待检测末梢血液，经离心，取上清液以作为血液样品。 5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，离心速度为3500rpm；离心持续时长为10min；所述血液样品的保存条件为，置于-20℃下保存直至分析前备用。 6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将一定量的混合内标工作液添加到所述血液样品中，并进行样品前处理以得到待测样品，包括：用移液枪移取一定量的混合内标工作液置于离心管中，再加入5μL-100μL所述血液样品，再加入一定量的沉淀蛋白试剂，在1500rpm-2500rpm的转速下涡旋混合2min-5min；涡旋混合后在离心管中加入一定量的萃取试剂，在1500rpm-2500rpm的转速下涡旋混合3min-10min，再在10000rpm-15000rpm的转速下高速离心4min-6min；移取一定量离心后的上清液至离心管中，并转移至氮气吹干装置上以将上清液吹干；移取一定量的复溶液至上清液吹干的离心管中，在1500rpm-2500rpm的转速下涡旋混合1min-3min，再在10000rpm-15000rpm的转速下高速离心4min-6min，得到待测样品。 7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述混合内标工作液的移取量为10μL；和/或，所述沉淀蛋白试剂为乙醇，乙醇的用量为100μL-300μL；和/或，所述萃取试剂为正己烷，正己烷的用量为1000μL-1400μL；和/或，所述复溶液为含体积比为65％-75％甲醇、体积比为0.05％-0.15％甲酸的水溶液，所述复溶液的用量为50μL-200μL。 8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述分别检测至少三个标准溶液之前，进一步包括：利用移液器移取10μL标准工作液、10μL所述混合内标工作液、80μL稀释液至离心管中，其中，所述标准工作液中含有浓度已知的25-羟基维生素D3和浓度已知的25-羟基维生素D2，所述稀释液中甲醇和水的占比为7:3；将该离心管在1500rpm-2500rpm的转速下涡旋混匀1min-2min后，移取上清液以得到标准溶液。 9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在所述得到标准溶液之前，进一步包括：选购25-羟基维生素D3浓度为100μg/mL、溶剂为甲醇的25-羟基维生素D3标准液，并转移至2mL冻存管，以得到第一标准储备液，并在-80℃下保存，有效期为1年；选购25-羟基维生素D2浓度为50μg/mL、溶剂为甲醇的25-羟基维生素D2标准液，并转移至2mL冻存管，以得到第二标准储备液，并在-80℃下保存，有效期为1年；取一定量的所述第一标准储备液、所述第二标准储备液置于一定体积的容量瓶中，用65％-75％的甲醇水溶液进行稀释并定容，以得到所述标准工作液，所述标准工作液中25-羟基维生素D3的浓度介于3.125ng/mL-400ng/mL之间，25-羟基维生素D2的浓度介于0.98ng/mL-125ng/mL之间，并在-80℃下保存，有效期为3个月；取0.5mg25-羟基维生素D3的同位素内标物的标准品，并置于5mL容量瓶，用甲醇进行溶解并定容，以得到第一内标储备液，并在-80℃下保存，有效期为1年；选购25-羟基维生素D2的同位素内标物的浓度为102μg/mL、溶剂为甲醇的标准液，并转移至2mL冻存管，以得到第二内标储备液，并在-80℃下保存，有效期为1年；取一定量的所述第一内标储备液、所述第二内标储备液置于一定体积的容量瓶中，用65％-75％的甲醇水溶液进行稀释并定容，以得到所述混合内标工作液，所述混合内标工作液中25-羟基维生素D3的同位素内标物的浓度为150ng/mL，25-羟基维生素D2的同位素内标物的浓度为50ng/mL，并在-80℃下避光保存，有效期为1年。 10.根据权利要求1至9中任一所述的方法，其特征在于， 25-羟基维生素D3的内标物为25-羟基维生素D3的同位素内标物，25-羟基维生素D2的内标物为25-羟基维生素D2的同位素内标物；和/或，所述至少三个标准溶液中，25-羟基维生素D3的浓度包括3.125ng/mL、6.25ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL中的至少三个，25-羟基维生素D2的浓度包括0.98ng/mL、1.95ng/mL、3.9ng/mL、7.8ng/mL、15.625ng/mL、31.25ng/mL、62.5ng/mL、125ng/mL中的至少三个。
所属类别：	发明专利