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原文传递不同基原黄精的特征降解糖谱鉴定方法

专利名称：	不同基原黄精的特征降解糖谱鉴定方法
摘要：	本发明公开了一种不同基原黄精的特征降解糖谱鉴定方法，涉及黄精基原鉴定的技术领域。鉴定方法包括如下步骤：黄精多糖提取和纯化，通过单因素考察和正交设计条件优化得到黄精多糖的HPLC特征降解糖谱，样品测定及聚类分析，特征降解糖谱的主成分分析等。对黄精药材的基原进行准确鉴定，进一步保证其临床应用的安全性和有效性，具有良好社会效益和一定的间接经济效益。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	河北;13
申请人：	河北大学
发明人：	郭怀忠;刘进宝;刘丹
专利状态：	有效
申请日期：	2023-08-21T00:00:00+0800
发布日期：	2023-11-17T00:00:00+0800
申请号：	CN202311050172.5
公开号：	CN117074560A
代理机构：	河北磅礴律师事务所
代理人：	孟玉敏
分类号：	G01N30/02;G01N30/06;G01N30/86;G01N30/88;G;G01;G01N;G01N30;G01N30/02;G01N30/06;G01N30/86;G01N30/88
申请人地址：	071002 河北省保定市五四东路180号
主权项：	1.不同基原黄精的特征降解糖谱鉴定方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤： (1)对黄精多糖进行提取和纯化，将提取纯化后的多糖粉末进行单因素试验考察：取多糖粉末10mg，加0.4mL一定浓度的HCl溶液对多糖粉末在不同条件下进行降解，得到黄精多糖部分降解液，降解过程分别考察不同降解温度、不同降解时间、不同浓度盐酸溶液对黄精多糖部分降解的影响，考察方法如下：黄精多糖部分降解液冷却后，使用NaOH溶液调节pH至中性，加水定容至1mL，摇匀，采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生，衍生溶液采用HPLC测定，将寡糖峰数目和寡糖峰面积按公式进行处理得到综合评分，公式为： M＝0.5X×100÷最大峰数目+0.5Y×100÷最大峰面积以此为评价指标得到的最优降解条件为温度80℃，盐酸浓度0.5mol/L，降解时间4h； (2)根据上述单因素考察结果，采用三因素三水平正交设计进行进一步的黄精多糖部分酸降解优化(指标同上)，得到的最优条件为温度80℃，盐酸浓度0.5mol/L，降解时间5h，正交试验的方差分析表明降解温度对其部分降解影响最大，其次为盐酸浓度，最后是降解时间，由于盐酸浓度及降解时间影响不显著，因此最终选择的降解条件为温度80℃，盐酸浓度0.3mol/L，降解时间3h； (3)采用上述优化的多糖部分酸降解条件对各黄精提取多糖进行降解，HPLC测定，得到10批样品的多糖部分降解谱(特征降解糖谱)，从利用该谱图进行基原鉴定和质量评价的角度考虑，以寡糖峰数目多及总峰面积大者为佳； (4)选取黄精多糖部分降解谱中的寡糖峰和单糖峰，以其峰面积为参数，运用数据统计软件对各谱图进行主成分分析，样品前三个主成分的累计方差贡献率达到85％，基本包含了全部变量所具有的信息，选前三个成分作为主成分，并运用其对黄精多糖的质量进行整体评价。通过聚类分析可知，不同基原的黄精，即多花黄精、鸡头黄精、滇黄精各自可以很好地聚到一起，从而实现了不同基原黄精的鉴定。 2.根据权利要求1所述的不同基原黄精的特征降解糖谱鉴定方法，其特征在于：步骤(1)中，对黄精多糖的提纯和纯化方法如下：将黄精粉碎，过60目筛，称取10g黄精粉末于圆底烧瓶中，加入200-300mL水，在80℃条件下回流提取2h，重复三次，合并提取液，对提取液过滤、离心，取上层清液浓缩至30mL，浓缩液加入无水乙醇使其醇浓度达80％，在4℃下静置过夜，4000rpm离心5min，弃上层清液，将沉淀水复溶后转移至分液漏斗中，加入相当于其体积1/5的Sevag试剂，剧烈振摇，4000rpm离心5min，取下层水相重复上述操作直至无白色絮状物产生为止，测量除蛋白后溶液的体积，加入四倍体积无水乙醇醇沉过夜，4000rpm离心5min，取下层沉淀，为黄精多糖，冻干备用。 3.根据权利要求1所述的不同基原黄精的特征降解糖谱鉴定方法，其特征在于：步骤(1)中，单因素试验考察时，控制变量方法如下： ①固定盐酸溶液浓度0.3mol/L、降解时间4h，考察不同降解温度(60、70、80、90、100℃)对黄精多糖部分降解的影响； ②固定盐酸溶液浓度0.3mol/L、降解温度80℃，考察不同降解时间(1、2、3、4、5h)对黄精多糖部分降解的影响； ③固定降解温度80℃、降解时间4h，考察不同浓度盐酸溶液(0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mol/L)对黄精多糖部分降解的影响。 4.根据权利要求1所述的不同基原黄精的特征降解糖谱鉴定方法，其特征在于：步骤(1)中，采用PMP衍生方法如下：取多糖降解液200μL，依次加入0.3mol/LNaOH溶液100μL及0.5mol/LPMP甲醇溶液100μL，涡旋混匀后70℃水浴30min。冷却后加入0.3mol/L HCl溶液100μL中和，再加入1mL三氯甲烷，涡旋混匀1min后12000rpm离心3min。 5.根据权利要求1所述的不同基原黄精的特征降解糖谱鉴定方法，其特征在于：步骤(1)中，HPLC条件如下：C18色谱柱(200mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈(A)-0.025mol/L磷酸盐缓冲溶液(B)(pH7.5)梯度洗脱；流速：0.8mL/min；检测波长：245nm；进样量：20μL。 6.根据权利要求1所述的不同基原黄精的特征降解糖谱鉴定方法，其特征在于：步骤(3)中，多糖部分降解谱中，标号1-8为聚合度依次降低的寡糖峰，9-14为单糖峰，9号峰为葡萄糖。
所属类别：	发明专利