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原文传递穿透支原体P35脂蛋白在SV-HUC-1细胞膜上的受体蛋白的用途及确定方法

专利名称：	穿透支原体P35脂蛋白在SV-HUC-1细胞膜上的受体蛋白的用途及确定方法
摘要：	本发明属于病原生物学和医学技术领域，特别涉及穿透支原体P35脂蛋白在SV‑HUC‑1细胞膜上的受体蛋白的用途及确定方法。本发明阐明了Mpe经P35黏附和入侵宿主细胞的机制，确定了ACTG1蛋白是Mpe‑P35蛋白黏附SV‑HUC‑1细胞的主要受体，实验验证了使用ACTG1处理后的P35脂蛋白和穿透支原体、再与SV‑HUC‑1细胞孵育时P35脂蛋白和穿透支原体对细胞的黏附明显减少，同时还实验验证了ACTG1蛋白的抗体能降低穿透支原体和P35脂蛋白对SV‑HUC‑1细胞的黏附，为利用SV‑HUC‑1细胞膜上的受体蛋白ACTG1或受体蛋白ACTG1的抗体制备治疗或预防与穿透支原体P35脂蛋白相互作用的药物提供了理论基础。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	湖南;43
申请人：	南华大学附属南华医院
发明人：	罗浩荡;曾焱华;黎霞;肖花;何军
专利状态：	有效
申请日期：	2023-06-10T00:00:00+0800
发布日期：	2023-11-28T00:00:00+0800
申请号：	CN202310684000.7
公开号：	CN117129684A
代理机构：	武汉华旭知识产权事务所
代理人：	高剑锋
分类号：	G01N33/68;G01N33/569;G01N33/58;G01N30/02;G01N30/72;G;G01;G01N;G01N33;G01N30;G01N33/68;G01N33/569;G01N33/58;G01N30/02;G01N30/72
申请人地址：	421002 湖南省衡阳市珠晖区东风南路336号
主权项：	1.利用SV-HUC-1细胞膜上的受体蛋白ACTG1制备治疗或预防与穿透支原体P35脂蛋白相互作用的药物中的用途。 2.利用权利要求1所述SV-HUC-1细胞膜上的受体蛋白ACTG1的抗体制备治疗或预防与穿透支原体P35脂蛋白相互作用的药物中的用途。 3.一种确定权利要求1中与穿透支原体P35脂蛋白相互作用的SV-HUC-1细胞膜上的受体蛋白ACTG1的方法，其特征在于包括以下步骤：步骤1.穿透支原体P35脂蛋白的表达纯化：诱导表达、纯化含P35全部氨基酸的重组蛋白P35，将所得重组蛋白P35浓缩并进行浓度鉴定；步骤2.重组蛋白P35抗体的制备：将重组蛋白P35与弗氏佐剂混合，对兔进行免疫、免疫后收集兔血清，将免疫球蛋白部分经连续硫酸铵沉淀法粗提纯，然后经溴化氰活化的琼脂糖4B偶联和洗脱对重组蛋白P35特异的抗体进行纯化；步骤3.判断P35是否为穿透支原体对SV-HUC-1细胞的黏附相关蛋白：分别培养SV-HUC-1细胞和穿透支原体；通过间接免疫荧光试验检测重组蛋白P35和穿透支原体黏附SV-HUC-1细胞的情况，以及检测步骤2所制备的重组蛋白P35抗体能否抑制穿透支原体对SV-HUC-1细胞的黏附；步骤4.分析SV-HUC-1细胞膜中可能与重组蛋白P35发生特异结合的受体蛋白：取SV-HUC-1细胞膜蛋白进行SDS-PAGE分析，然后切取与改良VOPBA实验中明显条带对应的40kDa～55kDa附近胶条进行HPLC-MS分析出SV-HUC-1细胞膜中可能与重组蛋白P35发生特异结合的受体蛋白为ACTG1和KRT8；步骤5.鉴定受体蛋白ACTG1和KRT8是否存在于SV-HUC-1细胞膜上并确定受体蛋白ACTG1和KRT8的分布情况：利用Westernblotting对受体蛋白进行鉴定，并通过间接免疫荧光观察其在SV-HUC-1细胞膜中的分布情况、确定受体蛋白ACTG1和KRT8在SV-HUC-1细胞上的定位；步骤6.验证两种受体蛋白ACTG1和KRT8是否能与重组蛋白P35发生相互作用：通过Far-western blotting、间接ELISA、免疫共沉淀和免疫荧光共定位4种独立的实验方法确定重组蛋白P35能与ACTG1发生特异结合、但不与KRT8发生相互作用；步骤7.验证ACTG1是否影响穿透支原体和重组蛋白P35对SV-HUC-1细胞的黏附：采用黏附-黏附抑制实验并利用间接免疫荧光观察ACTG1及其抗体对穿透支原体和重组蛋白P35黏附SV-HUC-1细胞的影响，最终确定ACTG1蛋白是Mpe-P35蛋白黏附SV-HUC-1细胞的主要受体。 4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤3中检测重组蛋白P35和穿透支原体黏附SV-HUC-1细胞的情况，以及检测重组蛋白P35抗体能否抑制穿透支原体对SV-HUC-1细胞的黏附的具体操作为： (1)铺板：取一瓶生长状态良好的SV-HUC-1细胞，加入完全培养基，吹打均匀；向带有无菌爬片的24孔板孔内加入细胞悬液和完全培养液，混匀后置于37℃，5％CO2培养箱中培养； (2)将细胞分组进行实验： ①rP35黏附组：更换新鲜培养基后，向孔内加入50μg/mL的rP35，所述rP35即重组蛋白P35，37℃孵育过夜； ②Mpe黏附组：更换新鲜培养基后，向孔内加入1×107CCU/mL的Mpe，所述Mpe即穿透支原体，37℃孵育过夜； ③抗体黏附抑制组：在与SV-HUC-1细胞孵育前，先将Mpe与rP35特异性兔抗或免疫前血清在37℃条件下预孵育2h，更换新鲜培养基后与细胞孵育； ④空白对照组：只更换新鲜培养基，其余不做任何处理； (3)固定：PBS冲洗细胞3次，洗涤后每孔加入4％的多聚甲醛，4℃固定细胞30min； (4)封闭：PBS洗涤4次，洗涤后每孔加入F-12K完全培养基，37℃封闭1h； (5)一抗：PBS洗涤3次，根据细胞分组加入不同的一抗； ①rP35黏附组：加入150μL的rP35兔抗，37℃孵育2h； ②Mpe黏附组：加入150μL的Mpe兔抗，37℃孵育2h； ③抗体黏附抑制组：加入150μL的Mpe兔抗，37℃孵育2h； ④空白对照组：加入150μL的rP35兔抗或Mpe兔抗，37℃孵育2h； (5)二抗：PBS洗涤5次，洗涤后加入Alexa Fluor 488偶联的羊抗兔IgG，避光37℃染色1h； (6)核染：PBS洗涤5次，洗涤后加入DAPI，避光37℃孵育10min； (7)制片：PBS洗涤5次，在载玻片上滴上抗荧光猝灭剂，取出爬片将细胞面铺在抗荧光猝灭剂上，并用指甲油封片，用倒置荧光显微镜观察。 5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤6中所述Far-western blotting的实验方法具体为： (1)将rP35蛋白煮样后进行跑胶、转膜、封闭； (2)TBST洗涤2次，每次4min，PVDF膜与SV-HUC-1细胞膜蛋白悬液4℃孵育过夜； (3)TBST洗涤6次，每次4min，分别与ACTG1兔抗和KRT8兔抗4℃孵育12h以上； (4)TBST洗涤6次，每次4min，与1:5000稀释的HRP偶联的羊抗兔IgG 37℃孵育1h； (5)TBST洗涤6次，每次4min；用滤纸稍吸干水分后滴加超敏ECL显影液在化学发光成像系统中拍照。 6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤6中所述间接ELISA的实验方法具体为： (1)包被rP35于酶标板上，洗涤并进行封闭； (2)PBST洗板2次，与ACTG1蛋白或KRT8蛋白37℃孵育2h，同时设置对照组； (3)PBST洗板4次，每次4min，实验组分别与1:2000稀释的ACTG1兔抗或1:2000稀释的KRT8兔抗37℃孵育2h； (4)PBST洗板4次，每次4minn，与1:5000稀释的HRP偶联的羊抗兔IgG 37℃孵育1h； (5)PBST洗板6次，每次4min，显色后使用酶标仪检测每孔的A450值。 7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤6中所述免疫共沉淀的实验方法具体为： (1)将200μL的SV-HUC-1细胞膜蛋白悬液与100μL的rP35蛋白(10μg/mL)混匀后置于冰上，水平摇床摇晃过夜，过夜后加入40μL 50％的ProteinA/G琼脂糖珠工作液，继续冰上摇晃2h以去除非特异性蛋白； (2)4℃，14000rpm离心15min，收集上清； (3)将上清分至5个EP管内，一管加入5X蛋白上样缓冲液煮沸10min后放入-20℃保存，其余四管分别加入rP35兔抗、ACTG1鼠抗、鼠IgG和兔IgG，冰上摇晃过夜； (4)过夜后每管加入10μL 50％的ProteinA/G琼脂糖珠工作液以捕获抗原抗体结合物，冰上摇晃过夜； (5)4℃，14000rpm离心15秒，PBS洗涤4次，弃上清后使用60μL的PBS重悬沉淀，重悬后加入12.5μL蛋白电泳上样缓冲液煮沸，并进行Western blotting分析。 8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤6中所述免疫荧光共定位的实验方法具体为： (1)细胞铺板培养12h后，固定封闭； (2)PBS洗涤3次后，向孔内加入rP35或Mpe，37℃孵育2h； (3)PBS洗涤4次后孔内一起加入ACTG1鼠抗和rP35兔抗或ACTG1鼠抗和Mpe兔抗血清，4℃孵育过夜； (4)PBS洗涤4次后加入Alexa Fluor 488偶联的羊抗兔二抗和Cy3标记的羊抗鼠二抗混合液，37℃避光染色1h； (5)PBS洗涤5次后，DAPI染核10min，洗涤制片后在倒置荧光显微镜下观察。 9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤7中观察ACTG1及其抗体对穿透支原体和重组蛋白P35黏附SV-HUC-1细胞的影响的具体操作为： (1)将SV-HUC-1细胞固定、封闭后分组进行实验： ①阳性对照组：细胞经洗涤后直接与150μL的rP35 50μg/mL或Mpe 1×107CCU/mL 37℃孵育2h；洗涤后与150μL的rP35兔抗或Mpe兔抗37℃孵育2h；洗涤后与150μL的Cy3标记的羊抗兔二抗37℃染色1h，核染制片后在倒置荧光显微镜下观察； ②ACTG1蛋白预处理组：rP35和Mpe先与ACTG1蛋白0.25mg/mL 37℃孵育2h，再与孔板中的SV-HUC-1细胞37℃孵育2h；随后与rP35兔抗或Mpe兔抗37℃孵育2h；用Cy3标记的羊抗兔二抗37℃染色1h，核染制片后在倒置荧光显微镜下观察； ③ACTG1抗体预孵育组：孔板中的SV-HUC-1细胞先与150μL的ACTG1抗体37℃孵育2h，洗涤后与rP35或Mpe在37℃下孵育2h；随后与rP35兔抗或Mpe兔抗37℃孵育2h；用Cy3标记的羊抗兔二抗37℃染色1h，核染制片后在倒置荧光显微镜下观察。
所属类别：	发明专利