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原文传递一种动态定量评估电穿孔后心肌细胞膜变化的方法

专利名称：	一种动态定量评估电穿孔后心肌细胞膜变化的方法
摘要：	本发明涉及传感检测技术，旨在提供一种动态定量评估电穿孔后心肌细胞膜变化的方法。该方法包括：将纯化后的动物心肌细胞种植于细胞电生理传感器件的培养腔中进行培养；在心肌细胞出现自发节律性搏动后，利用电穿孔控制与信号记录集成装置执行电穿孔操作，向细胞电生理传感器件施加瞬态脉冲电信号以诱导细胞膜打开其纳米孔，同时记录该过程中的细胞膜电生理信号的变化情况；根据电生理信号的振幅变化，评估细胞膜变化。本发明针对记录到的细胞动作电位进行统计分析，定量描述细胞膜的动态变化过程；与常规的图像识别等静态处理显著不同，能定量描述电穿孔后细胞膜上纳米孔整个动态演变过程。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	浙江;33
申请人：	浙江大学杭州国际科创中心
发明人：	胡宁;王浩
专利状态：	有效
申请日期：	2023-08-08T00:00:00+0800
发布日期：	2023-11-17T00:00:00+0800
申请号：	CN202310992812.8
公开号：	CN117074480A
代理机构：	杭州中成专利事务所有限公司
代理人：	周世骏
分类号：	G01N27/26;G01N33/487;C12M1/42;G;C;G01;C12;G01N;C12M;G01N27;G01N33;C12M1;G01N27/26;G01N33/487;C12M1/42
申请人地址：	311200 浙江省杭州市萧山区经济技术开发区建设三路733号
主权项：	1.一种动态定量评估电穿孔后心肌细胞膜变化的方法，其特征在于，该方法是基于下述细胞电生理传感监测系统实现的，该监测系统包括细胞电生理传感器件和电穿孔控制与信号记录集成装置；其中，所述细胞电生理传感器件包括由上至下依次布置的中空玻璃培养腔、纳米微电极阵列芯片和PCB适配器，纳米微电极阵列芯片固定在PCB适配器表面的中心位置，培养腔固定在微电极阵列芯片上；PCB适配器的上表面通过银浆与纳米微电极阵列芯片上的导线相连，在其下表面焊接插脚；PCB适配器的部分插脚通过排线连接至电穿孔控制与信号记录集成装置，后者通过线缆接至计算机和电源；所述电穿孔控制与信号记录集成装置，包括电脉冲控制模块、电信号调理模块、信号采集模块，分别用于脉冲电信号调控、滤波放大处理和电生理信号接收；所述动态定性评估电穿孔后心肌细胞膜变化的方法，包括以下步骤： (1)将细胞电生理传感器件用75％酒精灭菌和紫外照射后，以10μg/mL的纤维连接蛋白溶液涂覆器件表面，置于37℃、5.0％(v/v)CO2的培养箱中4小时以促进细胞粘附； (2)将纯化后的动物心肌细胞种植于培养腔中，继续在培养箱中培养； (3)在心肌细胞出现自发节律性搏动后，利用电穿孔控制与信号记录集成装置执行电穿孔操作，向细胞电生理传感器件施加瞬态脉冲电信号以诱导细胞膜打开其纳米孔，同时记录该过程中的细胞膜电生理信号的变化情况； (4)根据电生理信号的振幅变化，评估细胞膜变化：在电穿孔之前由于细胞膜的屏障作用，记录的是细胞膜外动作电位，反映了稳定的细胞-电极界面建立后的细胞膜状态；在电穿孔之后由于细胞膜上出现纳米孔，此时记录的信号是细胞内动作电位；信号在短时间内迅速上升到最大振幅，接着再逐渐衰减到相对较低水平，最后恢复到初始的细胞外电位；该信号的振幅变化过程，对应了电穿孔后细胞膜由最初穿孔、膨胀到部分恢复、稳定和最终再密封的整个演化过程；其中，在振幅迅速上升阶段，细胞膜形成纳米孔且在峰值时数量、尺寸和分布范围也更达到最大；在振幅逐渐衰减阶段，细胞膜的纳米孔逐渐恢复、收缩；当振幅趋于稳定时，细胞膜的纳米孔已重新封闭。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，利用电生理信号的振幅，进一步计算振幅变化率、能量积分和能量积分变化率；其中，振幅变化率是指细胞动作电位的幅值相对于时间的变化，能量积分是指细胞动作电位幅值的平方和，能量积分变化率是指能量积分相对于时间的变化；按下述方式进行评估：在振幅迅速上升阶段：能量积分变化率超过20mV2/s时，表明在细胞膜上开始形成纳米孔；信号振幅超过500μV时，表明在细胞膜上已形成有效的纳米孔；能量积分变化率逐渐降低接近0时，此时纳米孔达到最稳定状态；在振幅逐渐衰减阶段，能量积分变化率低于100mV2/s时，表明细胞膜上的纳米孔开始愈合；变化率低于20mV2/s时，表明纳米孔基本完全，此时振幅低于100μV；变化率由负值到接近0时，表明细胞膜上的纳米孔已完全恢复。 3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在进行电穿孔时，控制对动作电位的采样率为15～20kHz，施加电穿孔脉冲幅值为2～6V，脉宽为0.1～10ms，脉冲个数为1～1000个。 4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，记录电穿孔前的细胞外动作电位10s～10min，电穿孔后记录电位变化的时间为1～60min；电穿孔施加的脉冲幅值为3～4V，脉宽为0.2～4ms，脉冲个数为1～20个。 5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纳米微电极阵列芯片中，通道数为16～64，金属层为5～20nm的Ti和50～100nm的Au，绝缘层为2～5μm厚的SU8，电极直径为10～30μm；所述培养腔的直径为0.6～1.5cm。 6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将心肌细胞种植在培养腔中时，保证心肌细胞均匀覆盖在纳米微电极阵列芯片表面，且能融合为单层。
所属类别：	发明专利